图1 透射显微镜构造原理和光路

　　(a)透射电子显微镜; (b)透射光学显微镜

　　图1 为透射电子显微镜和光学显微镜的光路系统示意图。两者的光学成象原理是相同的。透射电镜和光学显微镜之间的差别主要有下列几个方面：

　　(1) 透射电镜的照明光源是电子束，光学显微镜的照明光源是可见光;

　　(2) 透射电镜是用电磁透镜来聚焦的，而光学显微镜是用玻璃透镜来聚焦;

　　(3) 透射电镜的物镜和投影镜(相当于目镜)之间装有一个中间镜，中间镜的引入不仅可以调节放大倍数，而且可以进行电子衍射操作;

　　(4) 透射电镜中电子束形成的象只能在荧光屏上才能显示出来，而光学显微镜中可见光形成的象是在毛玻璃或白色屏幕上显示出来。

　　(5) 为使电子能自由运动，不受与气体分子碰撞的影响，电子显微镜镜筒内必须保持很高的真空。

　　透射电子显微镜由电子光学系统、电源与控制系统及真空系统三部分组成。

　　电子光学系统通常称镜筒，是透射电子显微镜的核心。它分为三部分，即照明系统、成像系统和观察记录系统。图2是JEM -2101F 透射电子显微镜的外观和镜筒剖面示意图。

(a)

(b)

图2 JEM -2101F 透射电子显微镜外观和镜筒剖面示意图

　　一、照明系统

　　照明系统主要由电子枪、聚光镜、电子束平移和倾斜装置组成。其作用是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。为满足明场和暗场成像要求，照明束可在2～3º范围内倾斜。

　　(1)电子枪

　　电子枪是发射电子的照明光源，它实际上是一个由阴极、栅极和阳极组成的静电透镜。如图3所示，电子枪的阳极接地，阴极加上了负高压(-50~200kv)，栅极加上比阴极负几百至几千伏的偏压。电子枪为一个自偏压回路，起限制和稳定束流的作用。

(a)自偏压回路 (b)电子枪内的等位面

图3 电子枪

　　(2)聚光镜

图4 双聚光镜的原理图

　　聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，减小样品被照射面积，调节照明强度、孔径角和光斑大小。现在高性能的电子显微镜一般都采用双聚光镜系统，如图8-4所示。第一聚光镜是强激磁、短焦距的透镜，可将电子枪光斑缩小10~50倍;而第二聚光镜是弱激磁、长焦距透镜，适焦时放大倍数为2倍左右。如果电子枪第一交叉点的光斑直径为50μm，在样品平面上可获得2~10μm的照明电子束斑。双聚光镜系统还使得在第二聚光镜与物镜之间有足够的空间来安放样品台和其它附件。

 

　　二、成像系统

　　成像系统主要由物镜、中间镜和投影镜组成。

　　(1)物镜

　　物镜是最关键的透镜，用来形成样品的第一次放大象。物镜是一个强激磁、短焦距(f=1~ 3mm )的物镜，放大倍数较高，一般为100 ~300倍。

　　透射电子显微镜分辨率的高低主要取决于物镜的质量。物镜的分辨率主要取决于极靴的形状和加工精度。一般来说，极靴的内孔和上下极靴之间的距离越小，物镜的分辨率越高。目前高质量的物镜分辨率可达0.1nm。

　　(2)中间镜

　　中间镜是一个弱激磁、长焦距的变倍透镜。中间镜的作用有2个：

　　(1) 调节放大倍数。电子显微镜的总放大倍数是各级透镜放大倍数的乘积，在电镜操作过程中，通过改变中间镜的放大倍数(0~20倍)可以在相当大的范围内(如2000~200000倍)改变电镜的总放大倍数。

　　(2) 选择透射电子显微镜中的成像操作和电子衍射操作。如图8-5所示，如果中间镜的物平面和物镜的象平面重合，则在荧光屏上得到一张清晰的放大象，这就是电子显微镜的成像操作;如果中间镜的物平面和物镜的后焦面重合，则在荧光屏上得到的是一幅电子衍射花样，这就是透射电子显微镜中的电子衍射操作。成像操作和电子衍射操作的转换，是在固定中间镜的象距L2不变的情况下，通过改变中间镜的激磁电流而改变焦距f来实现的。

高倍放大 (b)电子衍射

图5 成像系统光路

　　(3)投影镜

　　投影镜的作用是把经中间镜放大(或缩小)的象(或电子衍射花样)进一步放大，并投影到荧光屏上。它是一个短焦距的强激磁透镜，它的景深和焦长都非常大。

 

　　三、观察和记录系统

　　观察和记录系统包括荧光屏和照相装置，在荧光屏下面有一个可以自动换片的照相暗盒。照相时只要将荧光屏垂直竖起，电子束即可使照相底片曝光。由于透射电子显微镜的焦长很大，虽然荧光屏和底片之间有数十厘米的间距，当荧光屏上观察到的图象聚焦清楚时，仍能保证底片上的图象清晰。

　　电子显微镜工作时，整个电子通道都必须处于真空中。新式的电子显微镜中电子枪、镜筒和照相室之间都装有气阀，各部分都可单独抽真空，因此在更换灯丝、清洗镜筒和更换底片时，并不破坏其它部分的真空状态。

　　电源和控制系统主要包括三部分：灯丝电源和高压电源，使电子枪产生稳定的高能照明电子束;各电磁透镜的稳压稳流电源，使各电磁透镜具有高的稳定度;电气控制电路，用来控制真空系统、电气合轴、自动聚焦、自动照相等。

　　透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的TEM像或衍射谱是至关重要的.投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束"透明"的样品，并要求保持高的分辨率和不失真.

　　电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数.一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大.对于100～200KV的透射电镜，要求样品的厚度为50～100nm，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约15nm(越薄越好).

　　透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型.不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备.

　　(1)粉末样品　　因为透射电镜样品的厚度一般要求在100nm以下，如果样品厚于100nm，则先要用研钵把样品的尺寸磨到100nm以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可.

　　(2)薄膜样品　　绝大多数的TEM样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织;析出相形态;分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等;也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用.制备薄膜样品分四个步骤：

　　a将样品切成薄片(厚度100～200微米)，对韧性材料(如金属)，用线锯将样品割成小于200微米的薄片;对脆性材料(如Si，GaAs，NaCl，MgO)可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直接切割.

　　b切割成φ3mm的圆片　　用超声钻或puncher将φ3mm薄圆片从材料薄片上切下来.

　　c预减薄　　使用凹坑减薄仪可将薄圆片磨至10μm厚.用研磨机磨(或使用砂纸)，可磨至几十μm.

　　d终减薄　　对于导电的样品如金属，采用电解抛光减薄，这方法速度快，没有机械损伤，但可能改变样品表面的电子状态，使用的化学试剂可能对身体有害.

　　对非导电的样品如陶瓷，采用离子减薄，用离子轰击样品表面，使样品材料溅射出来，以达到减薄的目的.离子减薄要调整电压，角度，选用适合的参数，选得好，减薄速度快.离子减薄会产生热，使样品温度升至100～300度，故最好用液氮冷却样品.样品冷却对不耐高温的材料是非常重要的，否则材料会发生相变，样品冷却还可以减少污染和表面损伤.离子减薄是一种普适的减薄方法，可用于陶瓷，复合物，半导体，合金，界面样品，甚至纤维和粉末样品也可以离子减薄(把他们用树脂拌合后，装入φ3mm金属管，切片后，再离子减薄).也可以聚集离子术(FIB)对指定区域做离子减薄，但FIB很贵.

　　对于软的生物和高分子样品，可用超薄切片方法将样品切成小于100nm的薄膜.这种技术的特点是样品不会改变，缺点是会引进形变.

　　(3)金属试样的表面复型　　即把准备观察的试样的表面形貌(表面显微组织浮凸)用适宜的非晶薄膜复制下来，然后对这个复制膜(叫做复型)进行透射电镜观察与分析.复型适用于金相组织，断口形貌，形变条纹，磨损表面，第二相形态及分布，萃取和结构分析等.

　　制备复型的材料本身必须是"无结构"的，即要求复型材料在高倍成像时也不显示其本身的任何结构细节，这样就不致干扰被复制表面的形貌观察和分析.常用的复型材料有塑料，真空蒸发沉积炭膜(均为非晶态物质)　.

　　常用的复型有：a塑料一级复型，分辨率为10～20nm;b炭一级复型，分辨率2nm，c塑料-炭二级复型，分辨率10～20nm;d萃取复型，可以把要分析的粒子从基体中提取出来，这种分析时不会受到基体的干扰.

　　除萃取复型外，其余复型只不过是试样表面的一个复制品，只能提供有关表面形貌的信息，而不能提供内部组成相，晶体结构，微区化学成分等本质信息，因而用复型做电子显微分析有很大的局限性，目前，除萃取复型外，其他复型用的很少.

　　TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE

　　利用电子，一般是利用电子透镜聚焦的电子束，形成放大倍数很高的物体图像的设备。

　　电子显微镜(以下简称电镜)属电子光学仪器。由于电子的德布罗意波波长比光波短几个量级，所以电镜具有高分辨成像的能力。首先发明的是透射电镜，由M.诺尔和E.鲁斯卡于1932年发明并突破了光学显微镜分辨极限。透射电子显微镜是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。通常，透射电子显微镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～百万倍，用于观察超微结构，即小于0.2?m、光学显微镜下无法看清的结构，又称"亚显微结构"。透射电镜 (TEM)　样品必须制成电子能穿透的，厚度为100～2000埃的薄膜。成像方式与光学生物显微镜相似，只是以电子透镜代替玻璃透镜。放大后的电子像在荧光屏上显示出来.

　　透射电子显微镜的成像原理可分为三种情况：

　　吸收像：当电子射到质量、密度大的样品时，主要的成相作用是散射作用。样品上质量厚度大的地方对电子的散射角大，通过的电子较少，像的亮度较暗。早期的透射电子显微镜都是基于这种原理。

　　衍射像：电子束被样品衍射后，样品不同位置的衍射波振幅分布对应于样品中晶体各部分不同的衍射能力，当出现晶体缺陷时，缺陷部分的衍射能力与完整区域不同，从而使衍射钵的振幅分布不均匀，反映出晶体缺陷的分布。

　　相位像：当样品薄至100?以下时，电子可以传过样品，波的振幅变化可以忽略，成像来自于相位的变化。

　　组件

　　电子枪：发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。

　　聚光镜：将电子束聚集，可用已控制照明强度和孔径角。

　　样品室：放置待观察的样品，并装有倾转台，用以改变试样的角度，还有装配加热﹑冷却等设备。

　　物镜：为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。物镜是决定透射电子显微镜分辨能力和成像质量的关键。

　　中间镜：为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流﹐可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。

　　透射镜：为高倍的强透镜，用来放大中间像后在荧光屏上成像。

　　此外还有二级真空泵来对样品室抽真空、照相装置用以记录影像。

　　透射电镜衬度(反差)的来源

　　TEM衬度的形成,物镜后焦面是起重要作用的部位。电子经样品散射后，相对光轴以同一角度进入物镜的电子在物镜后焦面上聚焦在一个点上。散射角越大，聚焦点离轴越远,如果样品是一个晶体,在后焦面上出现的是一幅衍射图样。与短晶面间距(或者说"高空间频率")对应的衍射束被聚焦在离轴远处。在后焦面上设有一个光阑。它截取那一部分电子不但对衬度，而且对分辨本领有直接的影响。如果光阑太小，把需要的高空间频率部分截去，那么和细微结构对应的高分辨信息就丢失了(见阿贝成像原理)。

　　样品上厚的部分或重元素多的部分对电子散射的几率大。透过这些部分的电子在后焦面上分布在轴外的多。用光阑截去部分散射电子会使"质量厚度"大的部位在像中显得暗。这种衬度可以人为地造成，如生物样品中用重元素染色，在材料表面的复形膜上从一个方向喷镀一层金属，造成阴阳面等。散射吸收(指被光阑挡住)衬度是最早被人们所认识和利用的衬度机制。就表面复型技术而言，它的分辨本领可达几十埃。至于晶体样品的衍衬像和高分辨的点阵像的衬度来源，见点阵像和电子衍衬像。

　　应用

　　透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50～100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。常用的方法有：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。

　　由透射电镜的工作原理可知，供透射电镜分析的样品必须对电子束是透明的;此外，所制得的样品还必须可以真实反映所分析材料的某些特征，因此，样品制备在透射电子显微分析技术中占有相当重要的位置，也是一个涉及面很广的题目。　　大体上透射电镜样品可分为间接样品和直接样品。我们下面将对间接样品的制备作简单介绍。

　　间接样品“复型”可以分为五步来进行：

　　第一步，在拟分析的样品表面滴一滴丙酮，将醋酸纤维素薄膜即A.C.纸覆盖其上，适当按压形成不夹气泡的一级复型;

　　第二步，待上述一级复型干燥后，小心地将其剥离，并将复制面向上平整地固定在玻璃片上;

　　第三步，将固定好复型地玻璃片连同一白瓷片置于真空镀膜室中，以垂直方向喷涂碳，以制备由塑料和碳膜构成地“复合复型”。白色瓷片表面在喷碳过程中颜色的变化可以表示碳膜的厚度。

　　第四步，将复合复型上要分析的区域剪为略小于样品台钢网的小方块后，使碳膜面朝里，贴在事先熔在干净玻璃片上的低熔点石蜡层上，石蜡液层冷凝后即把复合膜块固定在玻璃片上。将该玻璃片放入丙酮液中，复合复型的A.C.纸在丙酮中将逐渐被溶解，同时适当加热以溶解石蜡。

　　最后，待AC纸和石蜡溶解干净后，碳膜(即二级复型)将漂浮在丙酮液中，将其转移至清洁的丙酮液中清洗后，再转移至盛蒸馏水的器皿中。此时，由于水的表面张力，碳膜会平展地漂浮在水面，用样品铜网将其捞起，干燥后即可置于电镜下观察。

        概括

　　原子力显微镜(atomic force microscope，简称AFM)利用微悬臂感受和放大悬臂上尖细探针与受测样品原子之间的作用力，从而达到检测的目的，具有原子级的分辨率。由于原子力显微镜既可以观察导体，也可以观察非导体，从而弥补了扫描隧道显微镜的不足。原子力显微镜是由IBM公司苏黎世研究中心的格尔德·宾宁与斯坦福大学的Calvin Quate于一九八五年所发明的，其目的是为了使非导体也可以采用类似扫描探针显微镜(SPM)的观测方法。原子力显微镜(AFM)与扫描隧道显微镜(STM)最大的差别在于并非利用电子隧穿效应，而是检测原子之间的接触，原子键合，范德瓦耳斯力或卡西米尔效应等来呈现样品的表面特性。

　　详细

　　图1. 激光检测原子力显微镜探针工作示意图原子力显微镜的基本原理是：将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定，另一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触，由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力，通过在扫描时控制这种力的恒定，带有针尖的微悬臂将对应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动。利用光学检测法或隧道电流检测法，可测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化，从而可以获得样品表面形貌的信息。下面，我们以激光检测原子力显微镜(Atomic Force Microscope Employing Laser Beam Deflection for Force Detection,Laser-AFM)——扫描探针显微镜家族中最常用的一种为例，来详细说明其工作原理。

　　如图1所示，二极管激光器(Laser Diode)发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂(Cantilever)背面，并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位置检测器(Detector)。在样品扫描时，由于样品表面的原子与微悬臂探针尖端的原子间的相互作用力，微悬臂将随样品表面形貌而弯曲起伏，反射光束也将随之偏移，因而，通过光电二极管检测光斑位置的变化，就能获得被测样品表面形貌的信息。

　　子力显微镜——原理图在系统检测成像全过程中，探针和被测样品间的距离始终保持在纳米(10e- 9米)量级，距离太大不能获得样品表面的信息，距离太小会损伤探针和被测样品，反馈回路(Feedback)的作用就是在工作过程中，由探针得到探针-样品相互作用的强度，来改变加在样品扫描器垂直方向的电压，从而使样品伸缩，调节探针和被测样品间的距离，反过来控制探针-样品相互作用的强度，实现反馈控制。因此，反馈控制是本系统的核心工作机制。本系统采用数字反馈控制回路，用户在控制软件的参数工具栏通过以参考电流、积分增益和比例增益几个参数的设置来对该反馈回路的特性进行控制。

　　原子力显微镜的工作模式是以针尖与样品之间的作用力的形式来分类的。主要有以下3种操作模式：接触模式(contact mode) ，非接触模式( non - contact mode) 和敲击模式( tapping mode)。

　　接触模式

　　从概念上来理解，接触模式是AFM最直接的成像模式。正如名字所描述的那样，AFM 在整个扫描成像过程之中，探针针尖始终与样品表面保持紧密的接触，而相互作用力是排斥力。扫描时，悬臂施加在针尖上的力有可能破坏试样的表面结构，因此力的大小范围在10 - 10～10 - 6 N。若样品表面柔嫩而不能承受这样的力，便不宜选用接触模式对样品表面进行成像。

　　非接触模式

　　非接触模式探测试样表面时悬臂在距离试样表面上方5～10 nm 的距离处振荡。这时，样品与针尖之间的相互作用由范德华力控制，通常为10 - 12 N ，样品不会被破坏，而且针尖也不会被污染，特别适合于研究柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于要在室温大气环境下实现这种模式十分困难。因为样品表面不可避免地会积聚薄薄的一层水，它会在样品与针尖之间搭起一小小的毛细桥，将针尖与表面吸在一起，从而增加尖端对表面的压力。

　　敲击模式

　　敲击模式介于接触模式和非接触模式之间，是一个杂化的概念。悬臂在试样表面上方以其共振频率振荡，针尖仅仅是周期性地短暂地接触/ 敲击样品表面。这就意味着针尖接触样品时所产生的侧向力被明显地减小了。因此当检测柔嫩的样品时，AFM的敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对样品进行成像扫描，装置随即将有关数据输入系统，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最大距离等，用于物体表面分析。同时，AFM 还可以完成力的测量工作，测量悬臂的弯曲程度来确定针尖与样品之间的作用力大小。

　　三种模式的比较

　　接触模式(Contact Mode)：

　　优点：扫描速度快，是唯一能够获得“原子分辨率”图像的AFM垂直方向上有明显变化的质硬样品，有时更适于用Contact Mode扫描成像。

　　缺点：横向力影响图像质量。在空气中，因为样品表面吸附液层的毛细作用，使针尖与样品之间的粘着力很大。横向力与粘着力的合力导致图像空间分辨率降低，而且针尖刮擦样品会损坏软质样品(如生物样品，聚合体等)。

　　非接触模式(Non-Contact Mode)：

　　优点：没有力作用于样品表面。

　　缺点：由于针尖与样品分离，横向分辨率低;为了避免接触吸附层而导致针尖胶粘，其扫描速度低于Tapping Mode和Contact Mode AFM。通常仅用于非常怕水的样品，吸附液层必须薄，如果太厚，针尖会陷入液层，引起反馈不稳，刮擦样品。由于上述缺点，on-contact Mode的使用受到限制。

　　轻敲模式(Tapping Mode)：

　　优点：很好的消除了横向力的影响。降低了由吸附液层引起的力，图像分辨率高，适于观测软、易碎、或胶粘性样品，不会损伤其表面。

　　缺点：比Contact Mode AFM 的扫描速度慢。

　　其他模式

　　除了上面三种常见的三种工作模式外，原子力显微镜还可以进行下面的工作：

　　1、横向力显微镜(LFM)

　　横向力显微镜(LFM)是在原子力显微镜(AFM)表面形貌成像基础上发展的新技术之一。工作原理与接触模式的原子力显微镜相似。当微悬臂在样品上方扫描时，由于针尖与样品表面的相互作用，导致悬臂摆动，其摆动的方向大致有两个：垂直与水平方向。一般来说，激光位置探测器所探测到的垂直方向的变化，反映的是样品表面的形态，而在水平方向上所探测到的信号的变化，由于物质表面材料特性的不同，其摩擦系数也不同，所以在扫描的过程中，导致微悬臂左右扭曲的程度也不同，检测器根据激光束在四个象限中，(A+C)-(B+D)这个强度差值来检测微悬臂的扭转弯曲程度。而微悬臂的扭转弯曲程度随表面摩擦特性变化而增减(增加摩擦力导致更大的扭转)。激光检测器的四个象限可以实时分别测量并记录形貌和横向力数据。

　　2、曲线测量

　　SFM除了形貌测量之外，还能测量力对探针-样品间距离的关系曲线Zt(Zs)。它几乎包含了所有关于样品和针尖间相互作用的必要信息。当微悬臂固定端被垂直接近，然后离开样品表面时，微悬臂和样品间产生了相对移动。而在这个过程中微悬臂自由端的探针也在接近、甚至压入样品表面，然后脱离，此时原子力显微镜(AFM)测量并记录了探针所感受的力，从而得到力曲线。Zs是样品的移动，Zt是微悬臂的移动。这两个移动近似于垂直于样品表面。用悬臂弹性系数c 乘以Zt，可以得到力F=c·Zt。如果忽略样品和针尖弹性变形，可以通过s=Zt-Zs给出针尖和样品间相互作用距离s。这样能从Zt(Zs)曲线决定出力-距离关系F(s)。这个技术可以用来测量探针尖和样品表面间的排斥力或长程吸引力，揭示定域的化学和机械性质，像粘附力和弹力，甚至吸附分子层的厚度。如果将探针用特定分子或基团修饰，利用力曲线分析技术就能够给出特异结合分子间的力或键的强度，其中也包括特定分子间的胶体力以及疏水力、长程引力等。

　　3、纳米加工

　　扫描探针纳米加工技术是纳米科技的核心技术之一，其基本的原理是利用SPM的探针-样品纳米可控定位和运动及其相互作用对样品进行纳米加工操纵，常用的纳米加工技术包括：机械刻蚀、电致/场致刻蚀、浸润笔(Dip-Pen Nano-lithography，DNP)等。

　　随着科学技术的发展，生命科学开始向定量科学方向发展。大部分实验的研究重点已经变成生物大分子，特别是核酸和蛋白质的结构及其相关功能的关系。因为AFM的工作范围很宽，可以在自然状态(空气或者液体)下对生物医学样品直接进行成像，分辨率也很高。因此，AFM已成为研究生物医学样品和生物大分子的重要工具之一。AFM应用主要包括三个方面：生物细胞的表面形态观测;生物大分子的结构及其他性质的观测研究;生物分子之间力谱曲线的观测。

　　AFM对生物细胞的表面形态观察

　　AFM可以用来对细胞进行形态学观察，并进行图像的分析。通过观察细胞表面形态和三维结构，可以获得细胞的表面积、厚度、宽度和体积等的量化参数等。例如，利用AFM可以对感染病毒后的细胞表面形态的改变、造骨细胞在加入底物(钴铬、钛、钛钒等)后细胞形态和细胞弹性的变化、GTP对胰腺外分泌细胞囊泡高度的影响进行研究。利用AFM还可以对自由基损伤的红细胞膜表面精细结构的研究，直接观察到自由基损伤，以及加女贞子保护作用后，对红细胞膜分子形态学的影响。

　　生物大分子的结构及其他性质的观测研究

　　2.1 蛋白质

　　对于蛋白质，AFM的出现极大的推动了其研究进展。AFM可以观察一些常见的蛋白质，诸如白蛋白，血红蛋白，胰岛素及分子马达和噬菌调理素吸附在图同固体界面上的行为，对于了解生物相溶性，体外细胞的生长，蛋白质的纯化，膜中毒有很大帮助。例如，Dufrene 等利用AFM 考察了吸附在高分子支撑材料表面上的胶原蛋白的组装行为。结合X-射线光电子能谱技术和辐射标记技术，他们提出了一个定性解释其层状结构的几何模型。AFM 实验证实了胶原蛋白组装有时连续，有时不连续的性质，通过形貌图也提供了胶原蛋白纤维状结构特征。Quist等利用AFM 研究了白蛋白和猪胰岛素在云母基底上的吸附行为，根据AFM 图上不同尺寸的小丘状物质推测，蛋白质有时发生聚集，有时分散分布。Epand 等则利用AFM 技术研究了一类感冒病毒的红血球凝集素，首次展示了一种膜溶原蛋白自组装形成病毒折叠蛋白分子外域的实时过程。

　　在AFM 观察包裹有紫膜的噬菌调理素蛋白(BR) 的研究中，AFM 仪器的改进，检测技术的提高和制样技术的完善得到了集中的体现。在细胞中，分子马达可以将化学能转变为机械运动，防止因为布朗运动导致的细胞中具有方向性的活动出现错误，这些活动包括：肌浆球蛋白，运动蛋白，动力蛋白，螺旋酶，DNA 聚合酶和RNA 聚合酶等分子马达蛋白的共同特点是沿着一条线性轨道执行一些与生命活动息息相关的功能，比如肌肉的收缩，细胞的分化过程中染色体的隔离，不同细胞间的细胞器的置换以及基因信息的解码和复制等。由于分子马达本身的微型化，它们容易受更高的热能和大的波动的影响，了解马达分子如何正常有序工作就成为一项具有挑战性的任务。利用AFM，人们已经知道了肌动蛋白结合蛋白的结构信息和细胞运动过程中肌动蛋白骨架调控功能。

　　2.2 脱氧核糖核酸(DNA)

　　AFM液相成像技术的优点在于消除了毛细作用力，针尖粘滞力，更重要的是可以在接近生理条件下考察DNA 的单分子行为。DNA 分子在缓冲溶液或水溶液中与基底结合不紧密，是液相AFM面临的主要困难之一。硅烷化试剂,如3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和阳离子磷脂双层修饰的云母基底固定DNA 分子，再在缓冲液中利用AFM 成像，可以解决这一难题。在气相条件下阳离子参与DNA的沉积已经发展十分成熟，适于AFM 观察。在液相条件下，APTES 修饰的云母基底较常用。目前DNA的许多构象诸如弯曲，超螺旋，小环结构，三链螺旋结构，DNA 三通接点构象，DNA 复制和重组的中间体构象，分子开关结构和药物分子插入到DNA 链中的相互作用都广泛地被AFM考察，获得了许多新的理解。

　　2.3 核糖核酸( RNA)

　　AFM对RNA的研究还不是很多。结晶的转运RNA 和单链病毒RNA 以及寡聚Poly (A) 的单链RNA 分子的AFM 图像已经被获得。因为在于不同的缓冲条件下，单链RNA 的结构变化十分复杂，所以单链RNA 分子的图像不容易采集。(利用AFM成像RNA分子需要对样品进行特殊和复杂的处理。Bayburt 等借鉴Ni2 + 固定DNA 的方法在缓冲条件下获得了单链Pre-m RNA 分子的AFM 图像。他们的做法如下： (1) 用酸处理被Ni2 + 修饰的云母基底以增加结合力; (2) RNA 分子在70℃退火，慢慢将其冷却至室温再滴加在用酸处理过的Ni2 +-云母基底上。采用AFM 单分子力谱技术，在Mg2 + 存在的溶液中，Liphardt 等研究了形貌多变的RNA 分子的机械去折叠过程，发现了从发夹结构到三螺旋连接体这些RNA 分子三级结构的过渡态。随后他们又利用RNA 分子证实了可逆非平衡功函和可逆平衡自由能在热力学上的等效性。)

　　2.4 核酸与蛋白质复合物( Nuclearacids-Protein Complex)

　　DNA 和蛋白质分子的特定相互作用在分子生物学中起着关键作用。蛋白质与DNA 结合的精确位点图谱和不同细胞状态下结合位点的测定对于了解复杂细胞体系的功能与机理，特别是基因表达的控制都十分关键。AFM 作为一种高度分辨达0。1 nm，宽度分辨率为2 nm 左右的表面分析技术，已广泛地用于表征各类DNA-蛋白质的复合物。低湿度大气条件下，Rees 等利用AFM 在接触模式下考察了λ2PL 启动子在启动和关闭转录过程中对DNA 链弯曲程度的影响。此外，这个小组还研究了另外一种λ2转录因子，Cro-蛋白对DNA 弯曲的影响。为了研究Jun 蛋白的结合是否会引起DNA 链的弯曲，Becker等利用AFM研究了包含一个AP21 结合位点的线性化质粒DNA 与Jun 蛋白的复合物。Aizawa小组对DNA 蛋白激酶Ku 亚结构域和双链DNA断裂的相关性进行了研究。Kasas 等研究了大肠杆菌RNA 聚合酶(RNAP) 转录过程中的动态酶活性。他们的方法是在Zn2 + 存在的条件下，RNAP 能够松散或紧密地与DNA 模板进行结合，通过AFM 成像了解其动态过程。

　　2.5 细胞( Cell)

　　AFM 不仅能够提供超光学极限的细胞结构图像，还能够探测细胞的微机械特性，利用AFM 力-曲线技术甚至能够实时地检测细胞动力学和细胞运动过程。利用AFM 研究细胞很少用样品预处理，尤其是能够在近生理条件下对它们进行研究。

　　利用AFM 直接成像方法，可以对固定的活细胞和亚细胞结构进行了深入研究。这些研究获得了关于细胞器的构造，细胞膜和细胞骨架更详细的信息。将细胞固定在基底上再进行AFM 观察，可以得到细胞膜结构的皱褶，层状脂肪物，微端丝和微绒毛等特征。由于细胞质膜掩盖了细胞内部骨架，现在已经发展了一种仔细剥离该层膜的方法,并利用AFM 对剥离细胞膜后的结构进行了研究。

　　AFM 在细胞研究方面的一个最重要用途是对活细胞的动力学过程，细胞间的相互作用以及细胞对其内外干扰因素的响应进行实时成像目前，AFM已经可以对外来病毒感染的细胞进行实时考察。AFM还可以研究活性状态下血小板形状的变化情况和培养的胰腺细胞对淀粉消化酶的响应情况。

　　2.6病毒( Virus)

　　早期，AFM 在生物学上的应用主要集中在病毒研究。Kolbe 等首次研究了具有不同头尾结构的T4 噬菌体。Imai 及其合作者分别对烟草花叶病毒和各类噬菌体进行了考察。烟草花叶病毒( TMV) 或星形烟草花叶病毒(STMV) 是迄今研究得最多的病毒类型。在胶体溶液中，TMV非常类似已知的蛋白质行为，可以采用研究蛋白质的方法对其进行考察。利用AFM，可以研究高度过饱和和轻微过饱和条件下TMV的二维成核生长过程。AFM研究表明，当TYMV 暴露在平衡条件下的溶液中，TYMV 晶体的(101) 面逐层向上生长，晶格的结构缺陷如空位，单粒子，位错和聚集等现象在AFM 图上区分得十分清楚。Turner 等利用从AIDS 病毒中提取的逆转录酶修饰AFM横梁，使之成为一种能检测抑制酶的活力和筛选使AIDS 病毒失活药物的方法。自支撑磷脂膜与感冒病毒结合作用以及缺陷位点结构上底物暴露的磷脂单层效应和水合双层磷脂的检测被发展成了一种新型生物传感器，这种传感器能够从其它大分子中识别特定的病毒物质。这些结果都被AFM 图像所证实。

　　生物分子间力谱曲线的观测

　　对生物分子表面的各种相互作用力进行测量，是AFM的一个十分重要的功能。这对于了解生物分子的结构和物理特性是非常有意义的。因为这种作用力决定两种分子的相互吸引或者排斥，接近或者离开，化学键的形成或者断裂，生物分子立体构像的维持或者改变等等。在分子间作用力的支配下，还同时支配着生物体内的各种生理现象、生化现象、药物药理现象，以及离子通道的开放或关闭，受体与配体的结合或去结合，酶功能的激活或抑制等等。因此，生物分子间作用力的研究，在某种意义上说，就是对生命体功能活动中最根本原理的研究。这也为人们理解生命原理，提供了一个新的研究手段和工具。

　　将两种分子分别固定于AFM的基底和探针尖端上。然后使带有一种分子的探针尖端在垂直方向上不断地接近和离开基底上的另一种分子。这时，两种分子间的相互作用力，就是二者间的相对距离的函数。这种力与距离间的函数关系曲线，称之为力谱曲线。

　　利用AFM获得的力谱曲线在生物医学中的应用：在探测一个细胞之后，根据所遇到的阻力，AFM就会赋予一个表明细胞柔软度的数值。研究人员发现，尽管正常细胞的硬度各有不同，但癌细胞比正常细胞要柔软得多，所研究的胰腺、肺部和乳腺细胞均是如此。一些肿瘤的细胞可能比另外一些更为坚硬，那就意味着这些肿瘤恶化转移的可能性较小，对病人的威胁也较小。利用AFM还可以研究不同药物对癌细胞的影响。针对细胞用药后，AFM可以观察在药物的作用下细胞的变化情况。这样可以开发出比当前所用的药物毒性更小、但同样能够阻止正常细胞发生癌变的药物，以免因癌症扩散而危及生命。

　　1、表面形貌的表征

　　通过检测探针一样品作用力可表征样品表面的三维形貌，这是AFM最基本的功能。由于表面的高低起伏状态能够准确地以数值的形式获取，对表面整体图像进行分析可得到样品表面的粗糙度(Roughness)、颗粒度(Granularity)、平均梯度(Step Height)、孔结构和孔径分布等参数;对小范围表面图像分析还可得到表面物质的晶形结构、聚集状态、分子的结构、面积和表面积及体积等;通过一定的软件也可对样品的形貌进行丰富的三维模拟显示如等高线显示法、亮度一高度对应法等，亦可转换不同的视角，让图像更适于人的直观视觉。

　　2、表面物化属性的表征

　　AFM的一种重要的测量方法是力一距离曲线，它包含了丰富的针尖一样品作用信息。在探针接近甚至压入样品表面又随后离开的过程中，测量并记录探针所受到的力，就得到针尖和样品间的力一距离曲线。通过分析针尖一样品作用力，就能够了解样品表面区域的各种性质如压弹性、粘弹性、硬度等物理属性;若样品表面是有机物或生物分子，还可通过探针与分子的结合拉伸了解物质分子的拉伸弹性、聚集状态或空间构象等物理化学属性;若用蛋白受体或其它生物大分子对探针进行修饰(functionization)，探针则会具有特定的分子识别功能，从而了解样品表面分子的种类与分布等生物学特性。

　　3、AFM的功能拓展

　　根据针尖与样品材料的不同及针尖一样品距离的不同，针尖一样品作用力可以是原子间斥力、范德瓦尔斯吸引力、弹性力、粘附力、磁力和静电力以及针尖在扫描时产生的摩擦力。目前，通过控制并检测针尖一一样品作用力，AFM已经发展成为扫描探针显微镜家族(SPM Family)，不仅可以高分辨率表征样品表面形貌，还可分析与作用力相应的表面性质。摩擦力显微镜可分析研究材料的摩擦系数 ;磁力显微镜可研究样品表面的磁畴分布，成为分析磁性材料的强有力工具;利用电力显微镜可分析样品表面电势、薄膜的介电常数和沉积电荷等。另外，AFM还可对原子和分子进行操纵、修饰和加工，并设计和创造出新的结构和物质。

　　原子力显微镜是扫描探针显微镜的一种，人们经常把它和扫描电子显微镜相比，下面就来说下它俩各自的优缺点。

　　一、优点

　　原子力显微镜观察到的图像相对于扫描电子显微镜，原子力显微镜具有许多优点。不同于电子显微镜只能提供二维图像，AFM提供真正的三维表面图。同时，AFM不需要对样品的任何特殊处理，如镀铜或碳，这种处理对样品会造成不可逆转的伤害。第三，电子显微镜需要运行在高真空条件下，原子力显微镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作。这样可以用来研究生物宏观分子，甚至活的生物组织。

　　二、缺点

　　和扫描电子显微镜(SEM)相比，AFM的缺点在于成像范围太小,速度慢，受探头的影响太大。原子力显微镜(Atomic Force Microscope)是继扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microscope)之后发明的一种具有原子级高分辨的新型仪器，可以在大气和液体环境下对各种材料和样品进行纳米区域的物理性质包括形貌进行探测，或者直接进行纳米操纵;现已广泛应用于半导体、纳米功能材料、生物、化工、食品、医药研究和科研院所各种纳米相关学科的研究实验等领域中，成为纳米科学研究的基本工具。原子力显微镜与扫描隧道显微镜相比，由于能观测非导电样品，因此具有更为广泛的适用性。当前在科学研究和工业界广泛使用的扫描力显微镜(Scanning Force Microscope)，其基础就是原子力显微镜。

　　1. 光学显微镜以可见光为介质，电子显微镜以电子束为介质，由于电子束波长远较可见光小，故电子显微镜分辨率远比光学显微镜高。光学显微镜放大倍率最高只有约 1500倍，扫描式显微镜可放大到10000倍以上。

　　2. 根据de Broglie波动理论，电子的波长仅与加速电压有关：

　　λe=h / mv= h / (2qmV)1/2=12.2 / (V)1/2 (?)

　　在 10 KV 的加速电压之下，电子的波长仅为0.12?，远低于可见光的4000 - 7000?， 所以电子显微镜分辨率自然比光学显微镜优越许多，但是扫描式电子显微镜的电子束直径大多在50-100?之间，电子与原子核的弹性散射 (Elastic Scattering) 与非弹 性散射 (Inelastic Scattering) 的反应体积又会比原有的电子束直径增大，因此一般穿透式电子显微镜的分辨率比扫描式电子显微镜高。

　　3. 扫描式显微镜有一重要特色是具有超大的景深(depth of field)，约为光学显微 镜的300倍，使得扫描式显微镜比光学显微镜更适合观察表面起伏程度较大的样品。

　　4. 扫描式电子显微镜，其系统设计由上而下，由电子枪 发射电子 束，经过一组磁透镜聚焦 (聚焦后，用遮蔽孔径 选择电子束的尺寸后，通过一组控制电子束的扫描线圈，再透过物镜 聚焦，打在样品上，在样品的上侧装有讯号接收器，用以择取二次电子或背向散射电子成像。

　　5. 电子枪的必要特性是亮度要高、电子能量散布 要小，目前常用的种类计有三种，钨(W)灯丝、六硼化镧(LaB6)灯丝、场发射 (Field Emission)，不同的灯丝在电子源大小、电流量、电流稳定度及电子源寿命等均有差异。

　　6. 热游离方式电子枪有钨(W)灯丝及六硼化镧(LaB6)灯丝两种，它是利用高温使电子具有足够的能量去克服电子枪材料的功函数(work function)能障而逃离。对发射电流密度有重大影响的变量是温度和功函数，但因操作电子枪时均希望能以最低的温度来操作，以减少材料的挥发，所以在操作温度不提高的状况下，就需采用低功函数的材料来提高发射电流密度。

　　7. 价钱最便宜使用最普遍的是钨灯丝，以热游离 (Thermionization) 式来发射电子,电子能量散布为 2 eV，钨的功函数约为4.5eV，钨灯丝系一直径约100μm，弯曲成V形的细线，操作温度约2700K，电流密度为1.75A/cm2，在使用中灯丝的直径随着钨丝的蒸发变小，使用寿命约为40~80小时。

　　8. 六硼化镧(LaB6)灯丝的功函数为2.4eV，较钨丝为低，因此同样的电流密度，使用LaB6只要在1500K即可达到，而且亮度更高，因此使用寿命便比钨丝高出许多，电子能量散布为 1 eV，比钨丝要好。但因LaB6在加热时活性很强，所以必须在较好的真空环境下操作，因此仪器的购置费用较高。

　　9. 场发射式电子枪则比钨灯丝和六硼化镧灯丝的亮度又分别高出 10 - 100 倍，同 时电子能量散布仅为 0.2 - 0.3 eV，所以目前市售的高分辨率扫描式电子显微镜都采用场发射式电子枪，其分辨率可高达 1nm 以下。

　　10. 场发射电子枪可细分成三种:冷场发射式,热场发射式,及萧基发射式

　　11. 当在真空中的金属表面受到108V/cm大小的电子加速电场时，会有可观数量的电 子发射出来，此过程叫做场发射，其原理是高电场使电子的电位障碍产生Schottky效应，亦即使能障宽度变窄，高度变低，因此电子可直接"穿隧"通过此狭窄能障并离开 阴极。场发射电子系从很尖锐的阴极尖端所发射出来，因此可得极细而又具高电流密 度的电子束，其亮度可达热游离电子枪的数百倍，或甚至千倍。

　　12. 场发射电子枪所选用的阴极材料必需是高强度材料，以能承受高电场所加诸在阴 极尖端的高机械应力，钨即因高强度而成为较佳的阴极材料。场发射枪通常以上下一组阳极来产生吸取电子、聚焦、及加速电子等功能。利用阳极的特殊外形所产生的静电场，能对电子产生聚焦效果，所以不再需要韦氏罩或栅极。第一(上)阳极主要是改变场发射的拔出电压,以控制针尖场发射的电流强度，而第二 (下)阳极主要是决定加速电压，以将电子加速至所需要的能量。

　　13. 要从极细的钨针尖场发射电子，金属表面必需完全干净，无任何外来材料的原子

　　或分子在其表面，即使只有一个外来原子落在表面亦会降低电子的场发射，所以场发 射电子枪必需保持超高真空度，来防止钨阴极表面累积原子。由于超高真空设备价格 极为高昂，所以一般除非需要高分辨率SEM，否则较少采用场发射电子枪。

　　14. 冷场发射式最大的优点为电子束直径最小，亮度最高，因此影像分辨率最优。能 量散布最小，故能改善在低电压操作的效果。为避免针尖被外来气体吸附，而降低场发射电流，并使发射电流不稳定，冷场发射式电子枪必需在10-10 torr的真空度下操作，虽然如此，还是需要定时短暂加热针尖至2500K(此过程叫做flashing)，以去除 所吸附的气体原子。它的另一缺点是发射的总电流最小。

　　15. 热场发式电子枪是在1800K温度下操作，避免了大部份的气体分子吸附在针尖表面，所以免除了针尖flashing的需要。热式能维持较佳的发射电流稳定度，并能在较 差的真空度下(10-9 torr)操作。虽然亮度与冷式相类似，但其电子能量散布却比冷 式大3~5倍，影像分辨率较差，通常较不常使用。

　　16. 萧基发射式的操作温度为1800K，它系在钨(100)单晶上镀ZrO覆盖层，ZrO将功函 数从纯钨的4.5eV降至2.8eV，而外加高电场更使电位障壁变窄变低，使得电子很容易以热能的方式跳过能障(并非穿隧效应)，逃出针尖表面，所需真空度约10-8~10-9torr 。其发射电流稳定度佳，而且发射的总电流也大。而其电子能量散布很小，仅稍逊于冷场发射式电子枪。其电子源直径比冷式大，所以影像分辨率也比冷场发射式稍差一点。

　　17. 场发射放大倍率由25倍到650000倍，在使用加速电压15kV时，分辨率可达到1nm，加速电压1kV时，分辨率可达到2.2nm。一般钨丝型的扫描式电子显微镜仪器上的放大倍率可到200000倍，实际操作时，大部份均在20000倍时影像便不清楚了，但如果样品的表面形貌及导电度合适，最大倍率650000倍是可以达成的。

　　18. 由于对真空的要求较高，有些仪器在电子枪及磁透镜部份配备了3组离子泵(ion pump)，在样品室中，配置了2组扩散泵(diffusion pump)，在机体外，以1组机械泵负责粗抽，所以有6组大小不同的真空泵来达成超高真空的要求，另外在样品另有以液态氮冷却的冷阱(cold trap)，协助保持样品室的真空度。

　　19. 平时操作，若要将样品室真空亦保持在10-8pa(10-10torr)，则抽真空的时间将变长而降低仪器的便利性，更增加仪器购置成本，因此一些仪器设计了阶段式真空( step vacuum)，亦即使电子枪、磁透镜及样品室的真空度依序降低，并分成三个部份来读取真空计读数，如此可将样品保持在真空度10-5pa的环境下即可操作。平时待机或更换样品时，为防止电子枪污染，皆使用真空阀(gun valve)将电子枪及磁透镜部份与样品室隔离，实际观察时再打开使电子束通过而打击到样品。

　　20. 场发射式电子枪的电子产生率与真空度有密切的关系，其使用寿命也随真空度变差而急剧缩短，因此在样品制备上必须非常注意水气，或固定用的碳胶或银胶是否烤干，以免在观察的过程中，真空陡然变差而影响灯丝寿命，甚至系统当机。

　　21. 在电子显微镜中须考虑到的像差(aberration)包括:衍射像(diffraction aberration )、球面像差(spherical aberration)、散光像差(astigmatism)及波长散布像差(即色散像差，chromatic aberration)。

　　22. 面像差为物镜中主要缺陷，不易校正，因偏离透镜光轴之电子束偏折较大，其成像点较沿轴电子束成像之高斯成像平面(Gauss image plane)距透镜为近。

　　23. 散光像差由透镜磁场不对称而来，使电子束在二互相垂直平面之聚焦落在不同点上。散光像差一般用散光像差补偿器(stigmator)产生与散光像差大小相同、方向相反的像差校正，目前电子显微镜其聚光镜及物镜各有一组散光像差补偿器。

　　24. 光圈衍射像差(Aperture diffraction):由于电子束通过小光圈电子束产生衍射 现象，使用大光圈可以改善。

　　25. 色散像差(Chromatic aberration):因通过透镜电子束能量差异，使得电子束聚焦后并不在同一点上。

　　26.电子束和样品作用体积(interaction volume)，作用体积约有数个微米(μm)深， 其深度大过宽度而形状类似梨子。此形状乃源于弹性和非弹性碰撞的结果。低原子量的材料，非弹性碰撞较可能，电子较易穿进材料内部，较少向边侧碰撞，而形成梨子的颈部，当穿透的电子丧失能量变成较低能量时，弹性碰撞较可能，结果电子行进方向偏向侧边而形成较大的梨形区域。

　　27. 在固定电子能量时，作用体积和原子序成反比，乃因弹性碰撞之截面积和原子序 成正比，以致电子较易偏离原来途径而不能深入样品。

　　28. 电子束能量越大，弹性碰撞截面积越小，电子行走路径倾向直线而可深入样品，作用体积变大。

　　29. 电子束和样品的作用有两类，一为弹性碰撞，几乎没有损失能量，另一为非弹性 碰撞，入射电子束会将部份能量传给样品，而产生二次电子、背向散射电子、俄歇电子、X光、长波电磁放射、电子-空位对等。这些信号可供SEM运用者有二次电子、背向散射电子、X光、阴极发光、吸收电子及电子束引起电流(EBIC)等。

　　30. 二次电子(Secondary Electrons)：电子束和样品作用，可将传导能带(conduction band)的电子击出，此即为二次电子，其能量约 < 50eV。由于是低能量电子，所以 只有在距离样品表面约50~500?深度范围内所产生之二次电子，才有机会逃离样品表面而被侦测到。由于二次电子产生的数量，会受到样品表面起伏状况影响，所以二次电子影像可以观察出样品表面之形貌特征。

　　31. 背向散射电子(Backscattered Electrons)：入射电子与样品子发生弹性碰撞,而逃离样品表面的高能量电子，其动能等于或略小于入射电子的能量。背向散射电子产生的数量，会因样品元素种类不同而有差异，样品中平均原子序越高的区域，释放出来的背向散射电子越多，背向散射电子影像也就越亮，因此背向散射电子影像有时又称为原子序对比影像。由于背向散射电子产生于距样品表面约5000?的深度范围内，由于入射电子进入样品内部较深，电子束已被散射开来，因此背向散射电子影像分辨率不及二次电子影像。

　　32. X光：入射电子和样品进行非弹性碰撞可产生连续X光和特征X光，前者系入射电子减速所放出的连续光谱，形成背景决定最少分析之量，后者系特定能阶间之能量差 ，可藉以分析成分元素。

　　33. 电子束引致电流(Electron-beam induced Current , EBIC)：当一个p-n接面(Junction)经电子束照射后，会产生过多的电子-空位对，这些载子扩散时被p-n接面的电场收集，外加线路时即会产生电流。

　　34. 阴极发光(Cathodoluminescence)：当电子束产生之电子-空位对再结合时，会放出各种波长电磁波，此为阴极发光(CL)，不同材料发出不同颜色之光。

　　35. 样品电流(Specimen Current)：电子束射到样品上时，一部份产生二次电子及背向散射电子，另一部份则留在样品里，当样品接地时即产生样品电流。

　　36. 电子侦测器有两种，一种是闪烁计数器侦测器(Scintillator)，常用于侦测能量较低的二次电子，另一种是固态侦测器(solid state detector)，则用于侦测能量较高的反射电子。

　　37. 影响电子显微镜影像品质的因素:

　　A. 电子枪的种类:使用场发射、LaB6或钨丝的电子枪。

　　B. 电磁透镜的完美度。

　　C. 电磁透镜的型式: In-lens ,semi in-lens, off-lens

　　D. 样品室的洁净度: 避免粉尘、水气、油气等污染。

　　E. 操作条件: 加速电压、工作电流、仪器调整、样品处理、真空度。

　　F. 环境因素: 振动、磁场、噪音、接地。

　　38. 如何做好SEM的影像，一般由样品的种类和所要的结果来决定观察条件，调整适当的加速电压、工作距离 (WD)、适当的样品倾斜，选择适当的侦测器、调整合适的电子束电流。

　　39. 一般来说，加速电压提高，电子束波长越短，理论上，只考虑电子束直径的大小，加速电压愈大，可得到愈小的聚焦电子束，因而提高分辨率，然而提高加速电压却有一些不可忽视的缺点：

　　A. 无法看到样品表面的微细结构。

　　B. 会出现不寻常的边缘效应。

　　C. 电荷累积的可能性增高。

　　D. 样品损伤的可能性增高。

　　因此适当的加速电压调整，才可获得最清晰的影像。

　　40. 适当的工作距离的选择，可以得到最好的影像。较短的工作距离，电子讯号接收较佳，可以得到较高的分辨率，但是景深缩短。较长的工作距离，分辨率较差，但是影像景深较长，表面起伏较大的样品可得到较均匀清晰的影像。

　　41. SEM样品若为金属或导电性良好，则表面不需任何处理，可直接观察。若为非导体，则需镀上一层金属膜或碳膜协助样品导电，膜层应均匀无明显特征，以避免干扰样品表面。金属膜较碳膜容易镀，适用于SEM影像观察，通常为Au或Au-Pd合金或Pt。

　　而碳膜较适于X光微区分析，主要是因为碳的原子序低，可以减少X光吸收。

　　42. SEM样品制备一般原则为:

　　A. 显露出所欲分析的位置。

　　B. 表面导电性良好，需能排除电荷。

　　C. 不得有松动的粉末或碎屑(以避免抽真空时粉末飞扬污染镜柱体)。

　　D. 需耐热，不得有熔融蒸发的现象。

　　E. 不能含液状或胶状物质，以免挥发。

　　F. 非导体表面需镀金(影像观察)或镀碳(成份分析)。

　　43. 镀导电膜的选择，在放大倍率低于1000倍时，可以镀一层较厚的Au，以提高导电度。放大倍率低于10000倍时，可以镀一层Au来增加导电度。放大倍率低于100000倍 时，可以镀一层Pt或Au-Pd合金，在超过100000时，以镀一层超薄的Pt或Cr膜较佳。

　　44. 电子束与样品作用，当内层电子被击出后，外层电子掉入原子内层电子轨道而放 出X光，不同原子序，不同能阶电子所产生的X光各不相同，称为特征X光，分析特征X光，可分析样品元素成份。

　　45. 分析特征X光的方式，可分析特征X光的能量分布，称为EDS，或分析特征X光的波长，称为WDS。X光能谱的分辨率，在EDS中约有100~200eV的分辨率，在WDS中则有5~ 10eV的分辨率。由于EDS的分辨率较WDS差，因此在能谱的解析上，较易产生重迭的情形。

　　46. 由于电子束与样品作用的作用体积(interaction volume)的关系，特征X光的产 生和作用体积的大小有关，因此在平面的样品中，EDS或WDS的空间分辨率，受限于作用体积的大小。

　　无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

　　扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

　　但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：

　　尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

　　在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

　　样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

　　样品的前期处理

　　扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：

　　透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

　　扫描电镜要求完整且清洁表面，但是在许多样品的表面常附有粘液、血液、组织液及灰尘等杂物，妨碍着观察，以致造成对图像的错误解释，所以，在固定前都必须特别做好表面的清洁工作。

　　以下简介前期处理方法：

　　清洁'：对样品的清洁可根据不同的样品采用不同的方法，其中常用的方法有:

　　表面正常干燥的样品如叶、花瓣、茎等蜡叶标本，可用吹气球或用除尘器吹净，也可用软毛笔轻扫等方法除去表面的灰尘和其它杂物，但需注意不要损伤样品，吹风和清扫的力量取决于样品的硬度和污染的程度。

　　一般动植物组织，可用蒸馏水、生理盐水或缓冲液漂洗或冲洗。至于采用何种清洁液清洗，要视组织本身对清洗液渗透压变化的敏感程度而定，如用缓冲液清洗时，应与配制固定液的缓冲液一致，否则会因性质不同而产生化学反应从而影响固定效果。

　　对有油脂分泌物和蜡质覆盖层的样品如毛发、蚧虫等，应采用有机溶剂反复浸洗。

　　对一些附有粘液的组织可采用酶解法或其它试剂处理来清洗，如一般组织可用木瓜蛋白酶和淀粉酶清洗;肠粘膜可用糜蛋白酶清洗;用胰蛋白酶可分离和清洗胃粘膜的细胞。有些组织也可用试剂进行清洗，如要分离神经细胞可用稀释的乙二胺四醋酸处理，用甘油和稀释的乙醇延长浸渍时间可以从分泌乳腺中除去乳汁等。

　　对微小的样品要用离心法或放在用镍过滤网制的小容器中清洗。

　　对于特殊的样品还须用特殊的方法进行清洗。

　　固定: 样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有不同之处。

　　除采用戊二醛、四氧化锇、高锰酸钾等固定液进行固定外，还可采用下列几种固定液：

　　Sjodstrand固定液：

　　A液：氯化钠40.3g+氯化钾2.1g+钙0.9g+双蒸镏水500ml

　　B液：醋酸钠9.714g+凡罗那钠(Veronal)14.74g+双蒸馏水500m1

　　使用时吸取A液10ml，B液3.4ml，再加0/1mol/L盐酸11ml和锇酸05g+50ml蒸馏水

　　Dalton氏固定液：

　　此种固定液为4%重铬酸钾(pH7.2)与3.4%氯化钠等量混和后，再与2%四氧化锇等量混使即得。

　　这种固定液无沉渣，对样品损伤少。

　　在能保持样品不变形的前提下，不少样品(特别是植物样品)采用戊二醛单固定即可。

　　为了加强固定效果，还可将几种不同的固定液配合使用，进行双固定或多次固定(尤其是动物样品);如用用戊二醛作前固定，用锇酸作后固定。

　　脱水：脱水剂常用乙醇和丙酮。丙酮能使組织块变硬，是它的优点。

　　样品的干燥

　　生物样品的制备中，干燥是最关键的步骤。干燥过程除引起样品收缩之外，水的表面张力会使样品表面形貌发生很大的变化，这对扫描电镜的表面形貌观察特别有害。在透射电镜的样品制备中用乙醇脱水，是为了包埋剂的渗透(因水不与包埋剂互溶，而乙醇则能互溶)。而在扫描电镜的样品制备中，脱水是用表面张力小的乙醇取代表面张力很大的水，从而使干燥过程对样品表面产生的影响较少。然后就是如何设法使样品表面不受或少受表面张力影响的条件下除去乙醇，这就是干燥。目前常用的干燥方法主要有空气干燥法、临界点干燥法、冰冻干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等。

　　空气干燥法

　　空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。此法的最大优点是简单易行和节省时间，它的致命缺点是在干燥过程中，组织会因脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，此种方法一般只适用于外壳(表面)较为坚硬的样品。

　　在采用空气干燥时，为了减少样品的收缩变形，除使用易挥发和表面张力小的脱水剂如乙醇、丙酮等外，还应使样品得到充分固定，特别是须经四氧化锇固定效果才较好。因为它会使组织变得较为坚硬，使收缩变形减少。

　　然而，空气干燥引起的收缩并非完全不利，有时可以通过收缩使细胞之间相互剥离，从而能清楚地观察到一个个单独存在的细胞及其表面结构。此外，还可通过细胞成份在干燥时的收缩，观察到细胞内的线粒体、细胞核等成份的存在。但这种机会很少，而且因收缩带来的不利是主要的，所以，目前很少采用。

　　临界点干燥法

　　临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相/气相)，也就是消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所以样品不易收缩和损伤，此法所用的仪器结构不甚复杂，操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2h左右即可完成，所以，是最为常用的方法。

　　物质的临界点是1822年由Charles cagridde La Tour发现的。他将不同的液体分别装进玻璃试管并密封起来，然后一边转动一边加热，这时，他发现随着温度的升高，试管内的液相和气相之间的弯月面开始变得模糊起来，只有在试管冷却之后，弯月面才又重新出现。每种液体都存在某一温度，在这一温度时，液相的弯月面完全消失。

　　那么，弯月面的消失意味着什么呢?它意味着液相和气相之间的界面没有了，之所以出现这种现象，是因为在密封的容器里，液体受热膨胀，而气体本身被压缩，最后在某一特定的温度和压力下，液体由于膨胀，气体由于被压缩而使两者的密度相同，因而相互混合成一种均一的流体，原先存在它们之间的弯月面(即液面)就消失了，表面张力也自然消失了。因此，所谓临界点，就是指使物质的气态和液态两相之间达到相同密度，成为均一流体状态时的温度和压力的总称。此时的温度称临界温度;此时的压力称临界压力。

　　不同的物质都有其特定的临界点，一般用于扫描电镜样品临界点干燥的置换剂的临界温度和压力见表10-1。如果在临介点进行干燥，由于表面张力消失就不会造成样品表面的损伤。但进行临界点干燥，需用专用的临界点干燥器。具体处理步骤如下：

　　1.固定脱水 按透射电镜常规制样方法进行。

　　2.纯丙酮置换乙醇 如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100%后，用纯丙酮置换15～20min。

　　3.中间液处理 即在用丙酮置换乙醇后,用醋酸异戊酯(乙酸异戊B8)处理15-80min(也可以过夜)置换丙酶。由于醋酸异戊酯与液态二氧化碳能互溶，使液态二氧化碳容易渗入样品中。

　　4.装样 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。

　　5.注入液体二氧化碳 依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的进气阀在0～10℃下，向样品杯注入液体二氧化碳。

　　6.漂洗 当液体二氧化碳充至样品杯容积的50%(通过刻度尺观察，以液面超过样品笼为度)时，关闭仪器进气阀，静置15～20min，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后，打开仪器排气流量计阀门和进气阀门，让其边排气边充液10min左右，(让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出和充入新鲜的液态二氧化碳)再关闭排气阀;继续充入液体二氧化碳至样品杯的80%左右，关闭进液阀，停止充液。

　　7.加温置换 将温度调节设定在20℃处经15～20min后，由于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧化碳充分置换。

　　8.气化 将温度旋钮调至临界温度以上(35～40℃)，此时随着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳的临介点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时，经5min后，即可排气。

　　9.排气 在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量计的排气阀门，以1.0～1.51/min的速度排气(速度慢些更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。

　　临界点干燥的成败如何;与每一步的操作有很大关系，因此，操作时应注意以下事项：

　　1.在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃，因为温度过高，充入的液体二氧化碳会立即气化膨胀，压力增加，妨碍二氧化碳液体继续进入样品杯。

　　2.样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干燥而造成样品己变形，再进行临介点干燥也没有意义了。

　　3.一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而达不到临界点。

　　4.充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容积的2/3左右。

　　5.在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临界状态。

　　6."开"、"闭"阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在.4Omin以上，有时也可以放气过夜或过中午。

　　二氧化碳临界点干燥法除用液体二氧化碳外，也有用固体二氧化碳(干冰)作干燥介质的。与液体二氧化碳比较，固体二氧化碳有以下优点:

　　1.有利于微小样品的干燥，例如像玻璃片上的游离细胞，若用液体二氧化碳干燥，由于二氧化碳气体急剧地喷入样品杯内很可能使样品被吹掉，而用固体二氧化碳干燥，则完全没有这种危险。

　　2.不需要用钢瓶，钢瓶很重，搬运麻烦;用固体二氧化碳时，有适当大小的保温瓶(如冰壶)就可以了，因此很方便。

　　3.能保证二氧化碳装满样品室，即使用固体二氧化碳时，每次都能准确地放入足够酌量，而不会像使用液体二氧化碳时由于钢瓶中二氧化碳不足，充不进样品杯内，使样品干燥不完全而造成损伤。

　　4.夏天使用方便 在使用液体二氧化碳时，若室温超过临界温度，液体二氧化碳难以从钢瓶进入样品室，而固体二氧化碳则不受室温高低的影响，即无论多热的天气也能放进足够量。

　　5.不污染样品 使用液体时，往往由于钢瓶内有铁锈粉末充进样品杯而污染样品，而固体二氧化碳则无此种污染。

　　固体二氧化碳临界点干燥法除使用专门装置外，也可用任何一种液体临界点干燥器，不过由于液体临界点干燥器的样品室较小，操作起来不大方便。固体二氧化碳临界点干燥法的样品处理{固定、脱水等)与液体二氧化碳临界干燥法相同，所不同的是在于干燥时的具体操作。其操作步骤是：先将干冰用加热器切成样品杯容积大小的圆柱体(也可敲成碎块或粉末)，放于样品笼的顶部，盖好样品杯盖，然后加热到15℃，使干冰熔化成液体二氧化碳，这时干燥器内的压力上升，再加热到40C，使液体二氧化碳逐渐气化，压力继续上升达到临界值，几分钟后即可排气(温度不变)。当气体全部排出，压力回到零后，即取出样品，装台镀膜观察。

　　冰冻干燥法

　　冰冻干燥是将经冰冻的样品置于高真空中通过升华，除去样品中的水分或脱水剂的过程。冰冻干燥的基础是冰(或固态溶剂)从样品中升华，也就是使水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态,不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，因此，能较好地避免或减少了在干燥过程中对样品的损伤。冰冻干燥方法有两种，即含水样品直接冰冻干燥和样品脱水后从有机溶剂中冰冻干燥。

　　含水样品直接冰冻干燥法:

　　此法相对于临界点干燥有其明显优点，即能直接使含水样品冰冻干燥，不需要用有机溶剂脱水和置换，避免了无极性溶剂对样品成份的抽提作用，因此，不会使样品收缩和膜结构或表面物质产生穿蚀。如用此法干燥植物叶的样品，叶面角质层能保持自然状态，从而得到好的实验样品。

　　含水样品冰冻干燥的步骤如下：

　　1.取材固定，按常规方法进行。

　　2.冰冻保护剂渗透 将样品置于10%～20%的二甲基亚砜(DWSO)水溶液或15%～40%的甘油水溶液，或氯仿中浸泡数小时。

　　3.骤冷 将经保护剂处理过的样品迅速投入到用液氮预冷到一150℃的氟利昂12或氟利昂22冷冻剂中，使样品中的水分在片刻间冻结。

　　4.升华干燥 将已骤冷冻结的样品移到冰冻干燥器内已预冷的样台上(保持一70C以下),抽真空(真空度为10～10-1Pa)，经几小时或数天后，样品即达到干燥;

　　5.装台镀膜 先将冰冻干燥器的样品台加热至室温，然后将干燥器放气，取出样品迅速装台粘样，送入镀膜仪中镀膜。

　　但是这种方法也有其不足之处，就是干燥时间太长，如单层细胞也要几小时才能达到干燥，而几毫米厚的组织块可能要持续干燥一至数天，同时要判断是否干燥也较为困难，冰冻过程中会形成冰晶，使细胞成份因受冰晶挤压而产生移位和变形，造成人为的网状结构。因此必须采取一些防止这一不良情况产生的措施，以使样品的损伤减少到可以忽略的程度。

　　为了防止冰晶的形成，可采用以下办法：①用骤冷剂提高冰冻速度。常用的骤冷剂有氟利昂12和氟利昂22;此外，液态一固态氮的半凝固状混合物的温度可低至-210℃，因此可作为骤冷剂;②用冷冻保护剂如二甲基亚砜、甘油、明胶或氯仿处理样品，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小，以保护样品免受冰晶的损伤，尤其以氯仿处理的效果为好，因为氯仿易于挥发，不留在样品表面而影响观察。此外，透射电镜冰冻制样技术中的冷冻方法，也适用于扫描电镜。

　　样品脱水后的冰冻干燥:

　　这种方法是用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂如乙醚、氯仿、氟利昂113等中，然后连同这些溶剂一起冰冻并在真空中升华(直接用于脱水的乙醇作为冰冻干燥剂也有效)而达到样品干燥的;这种方法相对于前一种方法有下列优点;即有机溶剂在冰冻时形成非晶体固态，不像水那样结冰时膨胀，因此不会产生冰晶对样品的损伤。有机溶剂能以比水快得多的速度从固态中升华，因此，干燥时间比上一方法短得多，不需要专用的冰冻干燥装置，只用普通的真空干燥器加一块金属块作样品台即可。但此法也有不足之处，就是有机溶剂对样品成份有抽提作用，易造成部分内含物丢失。

　　此法的操作程序与前法基本相同，只是无需用冷冻保护剂处理而已。现将几种方法介绍如下：

　　氟利昂TF冷冻干燥法：

　　1.固定脱水按常规方法进行。

　　2.置换 按图中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液，并通过这些混合液将样品逐步引入100%氟利昂TF。

　　3.冷冻 把样品浸入液氮中冷冻。

　　4.干燥 将样品放在预先冷却的铝座上，再移入真空喷镀仪中抽真空(约1Pa)，经0～20min后即完全干燥。90min后铝座变为室温，即取出样品、装台、镀膜观察。

　　乙腈(acetonitrile)真空干燥法：

　　这是一种利用乙腈在急速蒸发时会冷却固化这一性质，将样品干燥的很独特的方法。其操作步骤如下：

　　1.固定、水洗按常规方法进行。

　　2.脱水 使用上升的系列乙腈(50%～100%)脱水各20min。

　　3.渗透 在容量约Iml的铝制容器中装满乙腈，并投入样品。

　　4.升华 把容器放入真空喷镀仪中抽真空，此时由于乙腈急速蒸发而使容器急剧冷却，其中乙腈也变成冰状固体。然后继续抽真空，使乙腈升华，约经30min，样品即达干燥。

　　5.待容器回升到室温后，即可取出样品装台镀膜进行观察。

　　据田中敬一报道此法干燥的效果与临界点干燥没有什么不同。

　　茨烯干燥法

　　莰烯是一种樟脑类无色结晶体，能溶于醚、环乙烷、环己烯和氯仿中，室温下呈固体状，能在较低的温度下升华，从固态直接变成气态，表面张力小，故经它干燥的样品较松软，变形小，操作也较简便。

　　莰烯干燥法是由Warrens.Buk于1971年提出的，其操作步骤如下：

　　1.取新鲜材料迅速投入0.1mol/L磷酸缓冲液中漂洗，然后投入5%的戊二醛(用磷酸缓冲液配制的pH7.4)中固定1h。

　　2.转至加有5.4%蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液中，在冷冻温度下过夜。

　　3.用l%的四氧化锇(磷酸缓冲液配制)溶液中固定2h。

　　4.用磷酸缓冲液或双蒸水漂洗2～3次，每次、15min。

　　5.用30%，50%，70%，90%，95%和100%丙酮脱水，每级15min。

　　6.用100%的苯脱酯。

　　7.在1：1苯与环氧丙烷中浸泡15min，再转至纯环氧丙烷中，在45℃下经20min后，转入预先在水浴箱中加温成液体的莰烯中浸透，取出样品装台。

　　8.放入真空干燥器中，在室温下抽真空1h左右，使莰烯直接从固体中升华，然后镀膜。

　　样品的装台粘胶

　　将样品装固在样品台上，最好采用导电胶。常用的导电胶有两种：一种是银粉导电胶，这是一种将很细的银粉拌在低电阻树脂液内制成的胶水，使用较为方便，这种树脂的绝缘电阻低，干后的电阻率仅为0.02Ω/mm，并可以被溶剂溶解还原,也有其它产品的银粉导电胶。另一种是将石墨粉拌在低电阻树脂液内的碳导电胶，它价格低廉，效果也很好。

　　对不镀膜而直接观察的样品，必须用导电胶来粘固，对于要镀膜的样品，则可以用其他胶水(如万能胶、乳胶等)来代替，微细的样品(如粉末、纤维)也可用双面胶纸来粘贴。

　　样品底面面积较小的样品(如圆形)，装台粘胶时，不能像图10-3(a)那样，胶水仅涂样品与样品台接触的那一小部分，这样不仅样品不易装固，而且镀膜时产生死角，金属膜层与样品台不相接，导性电能差，易产生充电现象，从而影响观察和拍照。因此，应多涂点胶，像图10-3(b)那样，这样就能保证镀层在最薄的情况下也能与样品台形成连续的导电膜，同时也使样品粘得牢;样品粘好后应待胶水层内外都干透后才进行镀膜和观察，否则会影响镀膜效果和污染电镜镜筒，尤其是光栏。

　　对于大块的多角形的厚样品，装台时，胶水也应涂成斜面。对纤维类样品，可以像牙刷那样穿在钻有孔的样品台上，齐根处涂以胶水加固(观察横切面时)或平粘于样品台上，两端用胶水固定(观察纤维表面时)。

　　对于微粒、粉末类样品粘胶时应尽量避免成团，以利于寻找典型图样和提高镀膜效果，对于此类样品，可制成稀的悬浮液，然后滴在样品台上，或在样品台上粘上双面胶纸后，用牙签缠上棉花蘸取粉末样品，再用吹气球将样品轻轻吹落在样品台上，效果也较好。

　　总之不论是那类样品，都应达到粘胶牢固，便于镀膜和图像背景美观清晰的要求。

　　样品的表面导电处理

　　生物样品和其他非金属样品的表面电阻率很高，在电镜观察时，往往容易发生荷电现象。另外，生物样品都是由低原子序数的碳、氢、氧、氮等元素组成，二次电子的发射率很低，信号弱，难以获得必要的图像反差。因此，为了消除或减少以上不良现象的产生，生物样品和非导电的样品在扫描电镜观察前，均需进行表面导电处理。扫描电镀样品的表面导电处理方法，主要有金属镀膜和组织导电处理两种。

　　金属镀膜法

　　金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯、银及碳等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜(或碳膜)后，不仅能为入射电子提供通路，消除电荷积累的荷电现象，而且能提高二次电子发射率，增加倍噪比，提高图像反差，以便能获得细节丰富和分辩率高的图像。其次，样品经镀膜后，还能提高样品表面的机械强度，增强耐受电子束轰击能力，避免起泡、龟裂、穿孔、分解和漂移等不良现象的产生：此外，通过镀膜能把扫描电镜的信息来源限定于样品表面，即防止来自组织内部的信息参与成像。

　　为了取得上述效果，所镀的金属膜应符合以下要求：

　　金属膜尽可能保持均匀的厚度，

　　膜本身没有结构，或者是微细到难以看出的程度。

　　膜要薄，不会掩盖样品表面原来的细微结构。

　　二次电子发射率好。

　　膜本身不因电子轰击而发生变化，在大气中保存样品不易变性(即化学稳定性好)。

　　根据上述要求，多采用金、钯、铂和金一钯、铂一钯及铂碳等材料并且应用真空镀膜及离子溅射方法镀膜等方法进行。现分别介绍如下：

　　真空镀膜法: 真空镀膜法是利用真空镀膜仪进行的。其原理是在高真空状态下(10-3Pa)，使某些金属物质加热到熔点以上时，蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，由于金属的沉积使样品表面形成一层薄金属膜。

　　真空镀膜法所得的膜，金属颗粒较粗，膜不够均匀，操作较复杂并且费时，因此目前已经较少使用。真空蒸发仪主要用于制造碳膜、碳复型膜和金属投影。

　　离子溅射镀膜法: 在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。图10一4就是这种镀膜法的原理示意图。这种装置很简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成，在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压，两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着在样品表面而形成金属导电膜。

　　离子溅射与真空镀膜比较，它具有以下优点：

　　粒子细，岛状结构少，约只有同一厚度的真空镀膜的1/5～1/10，膜层均匀。

　　对于凹凸不平较大的样品，也能形成很好的金属膜。

　　在膜的平均厚度一样时，溅射镀膜比真空镀膜的二次电子获得量大得多，故溅射镀膜的厚度可薄一些，所以能节省贵重金属用量。

　　所需真空度低，操作较容易，故节省时间。

　　溅射镀膜也有其不足之处，即：

　　溅射镀膜时，电子束和离子的冲击是不可避免的，因此软组织样品易受损伤。

　　虽不受辐射热影响，但放电电流增多时，样品有时会发热变形。

　　为使溅射取得满意的效果，操作时应注意以下几点：

　　样品要充分干燥，否则，金属颗粒不但不能附着，反而会引起样品损伤，特别是能放出有机气体的样品，有机气体会因放电而分解，使样品引起碳化污染。

　　加高压时辉光放电的颜色应为蓝色或紫蓝色，若是红色，应立即停止加高压，继续抽气。

　　不同金属靶应按表10-2所列条件进行操作。

　　加高压后，若真空度下降幅度较大，应立即停止镀膜，待充分抽气后再继续镀膜。

　　组织导电法

　　组织导电法是利用某些金属盐溶液对生物体中的蛋白质、脂肪类及淀粉等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。这种方法近年来国内外均有不少报道。

　　此法的基本处理过程，是将经过固定洗净的样品，用特殊的试剂处理后即可观察，具体程序见图10-5所示。此法由于不经过金属镀膜，所以不仅能节省时间，而且可以提高分辨率(可达20场?)，同时还可对样品进行边观察边解剖;组织导电处理还具有坚韧组织，加强固定效果的作用。经透射电镜观察表明，用组织导电法处理样品，不会产生细胞的收缩或损伤，细胞器保存完整。

　　用于组织导电的处理液应具备下列条件：

　　能对组织起染色作用;

　　组织结构保存完好;

　　不会污染样品;

　　不掩盖微细结构;

　　导电性良好：

　　二次电子发射量多，亮度大，反差强。

　　现将几种处理方法介绍如下：

　　碘化钾导电染色法: 碘化钾20g+碘0.2g+双蒸水lOOml+2.5%戊二醛10ml+葡萄糖0.2g。

　　此液性能缓和、纯净，不产生沉淀物和碎屑，可长期保存，使用方便，易于清洗。处理时间可由几分钟至几小时(视样品大小而定)。

　　碘化钾一醋酸铅导电法:

　　(A)碘化钾 20g

　　碘 0.2g

　　蒸馏水 l00ml

　　(B)氢氧化钾 4.08

　　醋酸铅 1.28

　　蒸馏水加至 l00ml

　　用时再稀释(1份母液+3份蒸馏水)，值得注意的是：由于醋酸铅与空气接触易产生沉淀，故用前应经过滤。其处理操作流程见图10-11所示。

　　单宁酸导电法: 单宁酸也称鞣酸，它能使蛋白质(包括许多络合物)沉淀，但氨基酸不沉淀。

　　此液的处理程序见图10-6所示。如经过2%四氧化饿固定(4℃)后，用2%～4%单宁酸加8%戊二醛处理1～4h(4'C)，再用2%四氧化锇处理2～4h，不仅反差好，而且分辨率高。

　　用于组织导电的处理液还有硝酸银导电液，重铬酸钾导电液及硫卡巴(Thiocarbohgdragide)导电液等，这里不再叙述了。为取得较好效果，在进行组织导电液处理时，应注意以下事项。

　　处理后的样品，必须充分洗净，否则析出的结晶与样品反应，在电子束的轰击下分解而污染镜筒。

　　经导电液处理的样品，可保存于70%～80%的酒精或1:1的酒精甘油中，但时间不要超过几小时。

　　要用优良的导电胶粘贴样品，并要在半干湿状态下装台，避免自然干燥而变形。

　　组织导电方法主要是提高表面导电率，延缓电子充电速度和提高二次电子发射率，并能消除电子的充电效应，但不能将二次电子的发射率提高到像金属那样大，所以应抓紧时间观察，倍率也不宜放得太大。

　　组织导电不能完全解决样品的收缩变形问题，故应将几种方法结合起来使用，以便相互补偿。

　　对于外壳极薄，内含流体比例很大以及鳞翅目一类的昆虫(有腊质和脂类的表面)的样品，用组织导电处理时，效果很差，甚至不起作用，故不宜采用此法。

　　放电防止液处理法 有人把用于防止毛毯和衣服放电的放电防止液处理样品，也取得一定的导电效果。这种试剂的成份尚不清楚，但它是用表面活性剂和铵盐以及烷基苯磺酸配制成的混合液。其处理方法是在样品脱水过程的最后阶段用这混合液浸泡10～6Omin，再进行临界点干燥，即可装台观察。

　　温性化学法 这是根据Goldman和leit试用的方法，样品用醛类固定，经氨银处理后再用洗相定影液处理，由于有还原的银而赋予可导电性。但有人认为，这种处理会发生人为假像，故应用实例很少。

　　X射线微区分析的生物样品制备

　　扫描电镜除了应用二次电子像研究样品表面形貌的主要用途外，另一个主要用途是应用特征X射线对样品进行微区成份分析。生物样品的X射线微区分析，是为了检测和测量生物基质中的元素在细胞、微粒甚至生物大分子的分布情况。其中，按其难易程度可分为定性分析和定量分析两类。定性分析的目的是断定细胞和组织某微区内是否存在某个特定的元素;定量分析的主要目的是尽量精确地得到给定组织某微区内所含特定元素的量。目前普通用的检测器探测生物组织中元素的最小量可达10-19g，其空间分辨率可达20～30nm。这种技术对生物学的研究是具有重大意义的。

　　由于二次电子像给出样品的形貌信息，而X射线微区分析给出样品的成份分析信息，因此，两者的样品制备是有差别的。二次电子像的样品制备着重保存其表面形貌而不顾及细胞可溶性成份的损失;X射线微区分析的样品制备技术必须既适当地保存结构细节，又保持待分析的元素组成在原位不变，同时具有较好的导热和导电性能。然而，要完全达到上述要求是十分困难的。因为生物样品是三维的、含水的、不稳定的绝缘体，主要是由浸在低浓度离子和电解质中的有机分子和大分子组成。其各元素的结合程度差别很大，从含硫的蛋白质中稳定的共价键到胞液中可以自由扩散的钾离子。尤其是活的生物材料是在不断地运动(包括明显的胞质运动以及胞内离子、电解质、分子和大分子间的相对运动)，而且也总在变化(包括新陈代谢和细胞机能结构的破坏和重建)。由于这些不稳定性，要进行X射线显微分析,就必须找到能瞬时阻止细胞活动的方法。研究表明，用常规的扫描电镜组织处理方法是不行的，因其处理过程，几乎所有的元素都会不同程度地丢失和重新分布，其丢失又很不均匀。例如：钾大量地丢失，但磷的丢失量却因组织间隙而异。同时在制备过程还会引入其他元素进入组织内。

　　因此，用干X射线微区分析的生物样品，应该满足以下要求：

　　样品的正常结构应能完好地保存;

　　必须了解样品中损失或者获得的物质的化学成份及其数量;

　　必须知道样品中元素的重新分布和位移;

　　样品制备所用的化学药品不应掩盖被分析的元素。

　　完全满足上述要求是困难的，只能设法尽可能地接近。由于生物材料的类型各式各样，如有块状样品、微生物、分离细胞和细胞器样品、纤维样品、液体样品和切片样品等，各种类型材料制备方法有所不同，而且要求检验的种类、分析的精度、仪器的类型等不同，样品制备方法也有所不同，我们不一一作介绍。切片样品(包括厚度为0.2～2.Oμm的厚切片和厚度为2OOnm以下的薄切片)具有既能从扫描透射像中获得较好的结构信息，又能获得较高的X射线空间分辩率，因此为最常用的方法，下面我们作简单的介绍。

　　室温制备方法

　　制备切片样品方法的步骤与通常超薄切片法的步骤相似，也经过取样、清洗、固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤。然而，由于对样品的要求两者有较大差异，在每个步骤的做法和要求也就不大相同。下面我们简单讨论一下;

　　取样和清洗

　　一般情况下，应尽快地从实验的机体上得到所需的组织切块。缺氧、受力和死后变化，不单对结构有重大的影响，而且对局部元素的浓度改变也有明显的影响。此外，还必须尽快地、认真地除去诸如血、粘液或胞外液等污染液，因为它们可能渗入样品中，产生虚假的X射线信号。清洗方法与二次电子像样品制备技术清洗方法相同。

　　固定

　　由Yorm，Holbrook等人的研究表明：所有的固定方法，对组织中的元素自然分布都有一些影响。冷冻生物学技术对于组织里的电解质浓度影响最小，而湿的化学方法的影响最严重。所有的固定剂对未结合的元素和结合的元素都存在有害影响。常用的有机醛类会使细胞中的可溶性物质大量损失，如果要使用醛类作固定剂，则事先要加入碳酸钡贮存，可能的话，最好使用新蒸馏液。如果用四氧化锇或高锰酸钾作后固定液，将会加重可溶性元素的损失，如果必须要固定组织的话，那么应注意以下几个问题：

　　1.固定的时间尽可能短;

　　2.最好使用蒸气固定，如用四氧化锇或甲醛蒸汽固定。它比通常的浸泡法固定，可减少可溶性元素再分布的影响，但蒸汽固定的浸透深度有限，仅是样品表面很浅的部分能获得成功，故只适用于极小块的组织。

　　3.缓冲液最好使用有机缓冲液，如碳酸缓冲液或醋酸佛罗那(Veronal acetate)缓冲液，而不要使用无机缓冲液，如二甲胂酸盐缓冲液等。因为后者存在诸如砷元素等进入细胞的危险。

　　4.固定的一个关键问题是：固定剂不应使被分析的元素造成损失、重新分布或干扰X射线的分析。所以，最好在每次固定前后对固定液进行检查，以测定其影响。

　　脱水

　　细胞和组织经过化学固定后，再经化学脱水，无疑会增加其中扩散物质的损失。乙醇、丙酮作脱水剂的影响，虽然未作严格的对比研究，但是似乎其差别不大.都是不太理想的脱水剂。对用于X射线微区成份分析的理想脱水剂尚未找到。改善的办法有：

　　用二甲氧基丙烷作脱水剂，Thorpe和Harvey用植物材料作试验.对比二甲氧基丙烷与丙酮脱水影响，二甲氧基丙烷对离子Na+、K+、Cl-的保存，有明显的改善。

　　把经固定的材料在一系列浓度递增的聚乙烯醇溶液(polyvinyl alcohol. Mw 1400)进行渗透.直到最终浓度为20%，于是水依靠渗析作用被除去，最后得到与戊二醛交联的硬凝胶。

　　包埋

　　为了切片.经过固定和脱水的生物组织需用树脂渗透和包埋.这会给X射线的分析带来影响;由：由于渗透，样品的质量增加.树脂将会稀释细胞的成份;树脂会抽提元素并使其重新分布;包埋过程必然会给被分析的组织增加元素。如某些环氧树脂含硫量相当高，而以环氧丙烷为基的环氧树脂含少量的氯。甚至使用含氯量极低的ERL-4206树脂(即Spurr树脂)，含量为0.73%，但在需要精确研究氯时，仍发现会干扰分析。因此，最好在样品包埋前将全部需用的包埋药品进行元素分析。

　　切片

　　虽然尚未看出切片对分析结果的影响，但一些因素仍须予以考虑：刀在切割样品时会逐渐磨损，应考虑在切片过程中刀刃材料消失到什么地方去了。金刚刀是纯碳制成的极硬，一般不大会对样品造成大污染，但玻璃刀含有硼、硅、钾以及其它微量元素，必须给予注意。另外，切片时使用的液槽及其槽液，必须十分注意保持清洁。最后，如果要求树脂切片展平，不要使用氯仿蒸汽，因为它很容易被树脂切片吸收，从而引起大量的氯污染。

　　染色和镀膜

　　染色过程与固定过程对成份分析的影响是相似的，都存在可溶性元素损失和引入重元素的危险，这些重元素的X射线会掩盖或干扰被分析的元素。因此，关于固定的讨论也适合于染色的过程。最好是不要进行染色。如果样品图像反差太弱无法识别，尽可能先用其他办法解决，实在非染色不可时，必须十分小心。

　　为了防止样品局部过热和防止电荷局部积累，通常在切片上喷镀上一薄的导电层。如果切片与支持铜网接触良好，而又进行能量分散X射线微区分析(EDX)，由于照射样品时间较短，可以不进行镀膜处理。如果进行波长分散x射线微区分析(WDX)，由于需要较强屯子束流和较长计数时间，则必须进行镀膜处理，其镀膜方法与前述相同。

　　低温制备方法

　　利用低温技术处理样品时，上述在室温制样过程中出现的许多问题都会大大减少。冷冻生物技术在生物样品的X射线分析研究中越来越重要，它大概是人们可望分析可溶性离子和元素的唯一途径。冷冻固定完全是个物理过程，能够显著地提高某些软生物组织的机械强度，水从液体转变为固体，抑制了生理过程，而且最大限度地减少可溶性物质的移动，因此，它大概是在接近自然状态下保存生物组织的唯一方法。此外，样品在低温下分析，还具有另一些优点：污染速率明显降低;样品在电子束下损伤较少。所以，这是一种较理想的方法，它与与冷冻超薄切片技术大致相同，主要区别是一个着重考虑结构，另一个着重考虑元素分析。下面就这些区别作简单讨论。

　　固定：对样品做任何形式的化学固定都能引起膜的渗透性发生显著变化，从而引起元素的重新分布，因此，最好不作任何化学固定。如果为了保持结构而必须固定时，最好是进行对照研究，一半样品经过固定，用于形态学研究，另一半不经固定，用于微区分析。

　　包埋: 为了便于进行切片，需将样品放在溶于生理亲合液的惰性物质中包埋，当样品被冷却时，包埋剂又可增加样品的机械强度，有利于切片。通常包埋剂有：琼脂、牛血清蛋白、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和浓度为10%～30%的羟乙基淀粉(HES)等。

　　冷冻保护: 在冷冻过程中，即使是极小的组织块，实际上或多或少总会产生冰晶损伤的，使用冷冻保护剂渗透样品，可大大减少冰晶损伤。研究表明：常用的穿透性冷冻保护剂如甘油和二甲基亚砜，虽然可以减小冰晶尺寸，能较好地保存结构，但却会给细胞带来严重的生理损伤，而且这些物质挥发性低，如果使用冷冻干燥技术，则难以将其去掉，因此，不适用于X射线分析。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟乙基淀粉(HES)能明显地减少细胞中冰晶损伤，较好地保存结构，同时对组织的生理机能造成的干扰最小，而且它们又是较好的包埋剂，有利于切片，因此，是较好的冷冻保护剂。

　　冷冻方法: 冷冻方法与冷冻技术一章讨论的基本相同，稍要注意的是：大部分生物材料进行X射线微区分析时，最好使用液氮，液态一氟二氯甲烷(84k)或含有8%甲基环乙烷的异戊烷(100k)冷却样品。如果进行含氯元素X射线分析，最好不要用碳氟化合物，否则微量卤族元素会留在冷冻样品中，影响分析结果。此外，组织冷冻一旦完成，应立即放入液氮中贮存或尽量保持低温以防止冰的再结晶。冷冻过程同样会引起可溶性元素的位移，但程度较轻。因为细胞内结冰的过程需要有一定的时间，这过程会有水的液相与固相共存的状态，此时，液体中电解质浓度显著增加，使膜的两侧附近的电化学梯度发生变化，因而反过来又造成某些离子的重新分布。

　　切片: 切片必须在低温下进行，以确保切片过程中不出现瞬间解冻以及重结晶的现象。切片可有两种方法：其一是在冷冻含水状态下进行制备以及其后的分析，它适合于胞外液的原位分析，厚切片常用此法，它要求所用的电镜或X射线分析仪必须备有冷冻台。另外，此法存在不少技术难点：在观测时，样品大量脱水，这会引起测量误差，尤其困难的是要确保样品在整个制备和观测过程中均处于冷冻、含水而又不受污染的状态。

　　另一种方法是：在冷冻干燥状态下进行制备以及其后分析。薄切片常用这种方法。具体可这样进行：先把组织块冷冻干燥，然后用树脂渗透、聚合，最后切片。也可以切片后再进行冷冻干燥，样品冷冻干燥需在专门的冷冻干燥仪中进行。冷冻干燥仪种类很多，但基本组成相同：

　　1.有一干燥室，包括一个冷冻台，保持足够低的温度，同以防止冰晶的生长或再生，有充气装置，以让干燥氮气进入干燥室;

　　2.有一个真空系统，以保持干燥室的压力在10-100mPa之间，这通常用扩散泵和机械泵来达到;

　　3.有一个水蒸汽吸附阱，使固体界面附近有很高的水蒸汽梯度，以提高干燥速度，最好的办法是装一个液氮冷阱，用以吸附水蒸汽。冷阱的温度比样品温度低摄氏20℃以上，它与样品距离应少于残余水蒸气分子的平均自由程。另外也可以利用诸如五氧化二磷或硅胶等化学干燥剂，但效果就不如液氮冷阱好。

　　干燥速度与样品温度、尺寸和形状、样品中结合水与游离水的相对量以及干燥室内的真空度都有关。选择什么温度进行干燥，是个有争议的问题。采用较低的温度，再结晶的危险减少，但干燥时间都大为增加，采用较高的温度，水分去除得较快，但却增加了再结晶的危险，同时会有溶质机体"塌陷"的危险。对于大多数样品，可在样品温度为190K和压力1～2mPa下开始干燥，冷凝器保持在77K，干燥后24～48h内，使温度逐渐回升到室温。如果采用先切片后干燥的办法，可把薄切片暴露在缓慢流动的干冷氮气中，氮气压力为大气压，温度为200K到170K之间，通常在1小时内干燥即可完成。

　　冷冻干燥过程会影响观察结果。冷冻干燥总会伴随一定程度的皱缩，但比临介点干燥引起的皱缩要小得多。此外，冷冻干燥过程由于支持机体的水分升华，先前溶解的成份必然在组织内重新分布，但由于溶质已与干燥的细胞基体交织在一起，其重新分布仅限于较短的距离。

　　许多学者的研究使人确信，对冷冻干燥样品进行定量X射线微区分析能够获得生理学上很有意义的数据。

　　一.明视野观察(Bright field BF)

　　明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切片，所有显微镜均能完成此功能。

　　明视野

　　二.暗视野观察(Dark field DF)

　　暗视野实际是暗场照明发。它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的象。

　　暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。

　　m..m 暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，最高达0.02—0.004

　　暗视野

　　三.相差镜检法(Phase contrast PH)

　　在光学显微镜的发展过程中，相差镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度)，对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本.

　　相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。

　　相差图片

　　相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ(波长)，如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：

　　1. 环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

　　2. 相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：

　　1. A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差(或称负反差)。

　　2. B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差(或称正反差)，结构比周围介质更加变暗

　　相差原理

　　四.微分干涉称镜检术(Differential interference contrast DIC)

　　微分干涉镜检术出现于60年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图象呈现出浮雕壮的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。

　　原理;

　　微分干涉称镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。

　　微分干涉图片

　　DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了偌玛斯斯棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y)，二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个偌玛斯斯棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。

　　这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕

　　微分干涉原理图

　　五.偏光显微镜(Polarizing microscope POL )

　　偏光显微镜的特点

　　偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色发来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。

　　偏光显微镜的特点，就是将普通改变为偏光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。

　　双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物，化学等领域。在生物学和植物学也有应用。

　　六.浮雕相衬显微镜(RC HMC )

　　1975年，Robert Hoffman 博士发明

　　2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品

　　原理

　　斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度

　　特点

　　提高未染色标本的可见性和对比度;

　　图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕;

　　可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ;

　　可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织;

　　聚光镜的工作距离可以设计的更长;

　　RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察

　　七：荧光显微镜(Fluorescence Microscopy FL)

　　荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。

　　荧光图象

　　优点：

　　• 检出能力高(放大作用)

　　• 对细胞的刺激小(可以活体染色)

　　• 能进行多重染色

　　用途：

　　• 物体构造的观察——荧光素

　　• 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等

　　• 发荧光量的测定对物质定性、定量分析

　　荧光原理图

　　1. 光学显微镜以可见光为介质，电子显微镜以电子束为介质，由于电子束波长远较可见光小，故电子显微镜分辨率远比光学显微镜高。光学显微镜放大倍率最高只有约1500倍，扫描式显微镜可放大到10000倍以上。

　　2. 根据de Broglie波动理论，电子的波长仅与加速电压有关：

　　λe=h / mv= h / (2qmV)1/2=12.2 / (V)1/2 (Å)

　　在 10 KV 的加速电压之下，电子的波长仅为0.12Å，远低于可见光的4000 - 7000Å，所以电子显微镜分辨率自然比光学显微镜优越许多，但是扫描式电子显微镜的电子束直径大多在50-100Å之间，电子与原子核的弹性散射 (Elastic Scattering) 与非弹性散射 (Inelastic Scattering) 的反应体积又会比原有的电子束直径增大，因此一般穿透式电子显微镜的分辨率比扫描式电子显微镜高。

　　3. 扫描式显微镜有一重要特色是具有超大的景深(depth of field)，约为光学显微镜的300倍，使得扫描式显微镜比光学显微镜更适合观察表面起伏程度较大的样品。

　　4. 扫描式电子显微镜，其系统设计由上而下，由电子枪 (Electron Gun) 发射电子束，经过一组磁透镜聚焦 (Condenser Lens) 聚焦后，用遮蔽孔径 (Condenser Aperture) 选择电子束的尺寸(Beam Size)后，通过一组控制电子束的扫描线圈，再透过物镜 (Objective Lens) 聚焦，打在样品上，在样品的上侧装有讯号接收器，用以择取二次电子 (Secondary Electron) 或背向散射电子 (Backscattered Electron) 成像。

　　5. 电子枪的必要特性是亮度要高、电子能量散布 (Energy Spread) 要小，目前常用的种类计有三种，钨(W)灯丝、六硼化镧(LaB6)灯丝、场发射 (Field Emission)，不同的灯丝在电子源大小、电流量、电流稳定度及电子源寿命等均有差异。

　　6. 热游离方式电子枪有钨(W)灯丝及六硼化镧(LaB6)灯丝两种，它是利用高温使电子具有足够的能量去克服电子枪材料的功函数(work function)能障而逃离。对发射电流密度有重大影响的变量是温度和功函数，但因操作电子枪时均希望能以最低的温度来操作，以减少材料的挥发，所以在操作温度不提高的状况下，就需采用低功函数的材料来提高发射电流密度。

　　7. 价钱最便宜使用最普遍的是钨灯丝，以热游离 (Thermionization) 式来发射电子，电子能量散布为 2 eV，钨的功函数约为4.5eV，钨灯丝系一直径约100µm，弯曲成V形的细线，操作温度约2700K，电流密度为1.75A/cm2，在使用中灯丝的直径随着钨丝的蒸发变小，使用寿命约为40~80小时。

　　8. 六硼化镧(LaB6)灯丝的功函数为2.4eV，较钨丝为低，因此同样的电流密度，使用LaB6只要在1500K即可达到，而且亮度更高，因此使用寿命便比钨丝高出许多，电子能量散布为 1 eV，比钨丝要好。但因LaB6在加热时活性很强，所以必须在较好的真空环境下操作，因此仪器的购置费用较高。

　　9. 场发射式电子枪则比钨灯丝和六硼化镧灯丝的亮度又分别高出 10 - 100 倍，同时电子能量散布仅为 0.2 - 0.3 eV，所以目前市售的高分辨率扫描式电子显微镜都采用场发射式电子枪，其分辨率可高达 1nm 以下。

　　10. 场发射电子枪可细分成三种:冷场发射式(cold field emission , FE)，热场发射式(thermal field emission ,TF)，及萧基发射式(Schottky emission ,SE)

　　11. 当在真空中的金属表面受到108V/cm大小的电子加速电场时，会有可观数量的电子发射出来，此过程叫做场发射，其原理是高电场使电子的电位障碍产生 Schottky效应，亦即使能障宽度变窄，高度变低，因此电子可直接"穿隧"通过此狭窄能障并离开阴极。场发射电子系从很尖锐的阴极尖端所发射出来，因此可得极细而又具高电流密度的电子束，其亮度可达热游离电子枪的数百倍，或甚至千倍。

　　12. 场发射电子枪所选用的阴极材料必需是高强度材料，以能承受高电场所加诸在阴极尖端的高机械应力，钨即因高强度而成为较佳的阴极材料。场发射枪通常以上下一组阳极来产生吸取电子、聚焦、及加速电子等功能。利用阳极的特殊外形所产生的静电场，能对电子产生聚焦效果，所以不再需要韦氏罩或栅极。第一(上)阳极主要是改变场发射的拔出电压(extraction voltage)，以控制针尖场发射的电流强度，而第二(下)阳极主要是决定加速电压，以将电子加速至所需要的能量。

　　13. 要从极细的钨针尖场发射电子，金属表面必需完全干净，无任何外来材料的原子或分子在其表面，即使只有一个外来原子落在表面亦会降低电子的场发射，所以场发射电子枪必需保持超高真空度，来防止钨阴极表面累积原子。由于超高真空设备价格极为高昂，所以一般除非需要高分辨率SEM，否则较少采用场发射电子枪。

　　14. 冷场发射式最大的优点为电子束直径最小，亮度最高，因此影像分辨率最优。能量散布最小，故能改善在低电压操作的效果。为避免针尖被外来气体吸附，而降低场发射电流，并使发射电流不稳定，冷场发射式电子枪必需在10-10 torr的真空度下操作，虽然如此，还是需要定时短暂加热针尖至2500K(此过程叫做flashing)，以去除所吸附的气体原子。它的另一缺点是发射的总电流最小。

　　15. 热场发式电子枪是在1800K温度下操作，避免了大部份的气体分子吸附在针尖表面，所以免除了针尖flashing的需要。热式能维持较佳的发射电流稳定度，并能在较差的真空度下(10-9 torr)操作。虽然亮度与冷式相类似，但其电子能量散布却比冷式大3~5倍，影像分辨率较差，通常较不常使用。

　　16. 萧基发射式的操作温度为1800K，它系在钨(100)单晶上镀ZrO覆盖层，ZrO将功函数从纯钨的4.5eV降至2.8eV，而外加高电场更使电位障壁变窄变低，使得电子很容易以热能的方式跳过能障(并非穿隧效应)，逃出针尖表面，所需真空度约10-8~10-9torr。其发射电流稳定度佳，而且发射的总电流也大。而其电子能量散布很小，仅稍逊于冷场发射式电子枪。其电子源直径比冷式大，所以影像分辨率也比冷场发射式稍差一点。

　　17. 场发射放大倍率由25倍到650000倍，在使用加速电压15kV时，分辨率可达到1nm，加速电压1kV时，分辨率可达到2.2nm。一般钨丝型的扫描式电子显微镜仪器上的放大倍率可到200000倍，实际操作时，大部份均在20000倍时影像便不清楚了，但如果样品的表面形貌及导电度合适，最大倍率 650000倍是可以达成的。

　　18. 由于对真空的要求较高，有些仪器在电子枪及磁透镜部份配备了3组离子泵(ion pump)，在样品室中，配置了2组扩散泵(diffusion pump)，在机体外，以1组机械泵负责粗抽，所以有6组大小不同的真空泵来达成超高真空的要求，另外在样品另有以液态氮冷却的冷阱(cold trap)，协助保持样品室的真空度。

　　19. 平时操作，若要将样品室真空亦保持在10-8pa(10-10torr)，则抽真空的时间将变长而降低仪器的便利性，更增加仪器购置成本，因此一些仪器设计了阶段式真空(step vacuum)，亦即使电子枪、磁透镜及样品室的真空度依序降低，并分成三个部份来读取真空计读数，如此可将样品保持在真空度10-5pa的环境下即可操作。平时待机或更换样品时，为防止电子枪污染，皆使用真空阀(gun valve)将电子枪及磁透镜部份与样品室隔离，实际观察时再打开使电子束通过而打击到样品。

　　20. 场发射式电子枪的电子产生率与真空度有密切的关系，其使用寿命也随真空度变差而急剧缩短，因此在样品制备上必须非常注意水气，或固定用的碳胶或银胶是否烤干，以免在观察的过程中，真空陡然变差而影响灯丝寿命，甚至系统当机。

　　21. 在电子显微镜中须考虑到的像差(aberration)包括:衍射像差(diffraction aberration)、球面像差(spherical aberration)、散光像差(astigmatism)及波长散布像差(即色散像差，chromatic aberration)。

　　22. 面像差为物镜中主要缺陷，不易校正，因偏离透镜光轴之电子束偏折较大，其成像点较沿轴电子束成像之高斯成像平面(Gauss image plane)距透镜为近。

　　23. 散光像差由透镜磁场不对称而来，使电子束在二互相垂直平面之聚焦落在不同点上。散光像差一般用散光像差补偿器(stigmator)产生与散光像差大小相同、方向相反的像差校正，目前电子显微镜其聚光镜及物镜各有一组散光像差补偿器。

　　24. 光圈衍射像差(Aperture diffraction):由于电子束通过小光圈电子束产生衍射现象，使用大光圈可以改善。

　　25. 色散像差(Chromatic aberration):因通过透镜电子束能量差异，使得电子束聚焦后并不在同一点上。

　　26. 电子束和样品作用体积(interaction volume)，作用体积约有数个微米(μm)深，其深度大过宽度而形状类似梨子。此形状乃源于弹性和非弹性碰撞的结果。低原子量的材料，非弹性碰撞较可能，电子较易穿进材料内部，较少向边侧碰撞，而形成梨子的颈部，当穿透的电子丧失能量变成较低能量时，弹性碰撞较可能，结果电子行进方向偏向侧边而形成较大的梨形区域。

　　27. 在固定电子能量时，作用体积和原子序成反比，乃因弹性碰撞之截面积和原子序成正比，以致电子较易偏离原来途径而不能深入样品。

　　28. 电子束能量越大，弹性碰撞截面积越小，电子行走路径倾向直线而可深入样品，作用体积变大。

　　29. 电子束和样品的作用有两类，一为弹性碰撞，几乎没有损失能量，另一为非弹性碰撞，入射电子束会将部份能量传给样品，而产生二次电子、背向散射电子、俄歇电子、X光、长波电磁放射、电子-空位对等。这些信号可供SEM运用者有二次电子、背向散射电子、X光、阴极发光、吸收电子及电子束引起电流(EBIC) 等。

　　30. 二次电子(Secondary Electrons)：电子束和样品作用，可将传导能带(conduction band)的电子击出，此即为二次电子，其能量约 < 50eV。由于是低能量电子，所以只有在距离样品表面约50~500Å深度范围内所产生之二次电子，才有机会逃离样品表面而被侦测到。由于二次电子产生的数量，会受到样品表面起伏状况影响，所以二次电子影像可以观察出样品表面之形貌特征。

　　31. 背向散射电子(Backscattered Electrons)：入射电子与样品子发生弹性碰撞，而逃离样品表面的高能量电子，其动能等于或略小于入射电子的能量。背向散射电子产生的数量，会因样品元素种类不同而有差异，样品中平均原子序越高的区域，释放出来的背向散射电子越多，背向散射电子影像也就越亮，因此背向散射电子影像有时又称为原子序对比影像。由于背向散射电子产生于距样品表面约5000Å的深度范围内，由于入射电子进入样品内部较深，电子束已被散射开来，因此背向散射电子影像分辨率不及二次电子影像。

　　32. X光：入射电子和样品进行非弹性碰撞可产生连续X光和特征X光，前者系入射电子减速所放出的连续光谱，形成背景决定最少分析之量，后者系特定能阶间之能量差，可藉以分析成分元素。

　　33. 电子束引致电流(Electron-beam induced Current , EBIC)：当一个p-n接面(Junction)经电子束照射后，会产生过多的电子-空位对，这些载子扩散时被p-n接面的电场收集，外加线路时即会产生电流。

　　34. 阴极发光(Cathodoluminescence)：当电子束产生之电子-空位对再结合时，会放出各种波长电磁波，此为阴极发光(CL)，不同材料发出不同颜色之光。

　　35. 样品电流(Specimen Current)：电子束射到样品上时，一部份产生二次电子及背向散射电子，另一部份则留在样品里，当样品接地时即产生样品电流。

　　36. 电子侦测器有两种，一种是闪烁计数器侦测器(Scintillator)，常用于侦测能量较低的二次电子，另一种是固态侦测器(solid state detector)，则用于侦测能量较高的反射电子。

　　37. 影响电子显微镜影像品质的因素:

　　A. 电子枪的种类:使用场发射、LaB6或钨丝的电子枪。

　　B. 电磁透镜的完美度。

　　C. 电磁透镜的型式: In-lens ,semi in-lens, off-lens

　　.D. 样品室的洁净度: 避免粉尘、水气、油气等污染。

　　.E. 操作条件: 加速电压、工作电流、仪器调整、样品处理、真空度。

　　F. 环境因素: 振动、磁场、噪音、接地。

　　38. 如何做好SEM的影像，一般由样品的种类和所要的结果来决定观察条件，调整适当的加速电压、工作距离 (WD)、适当的样品倾斜，选择适当的侦测器、调整合适的电子束电流。

　　39. 一般来说，加速电压提高，电子束波长越短，理论上，只考虑电子束直径的大小，加速电压愈大，可得到愈小的聚焦电子束，因而提高分辨率，然而提高加速电压却有一些不可忽视的缺点：

　　A. 无法看到样品表面的微细结构。

　　B. 会出现不寻常的边缘效应。

　　C. 电荷累积的可能性增高。

　　D. 样品损伤的可能性增高。

　　因此适当的加速电压调整，才可获得最清晰的影像。

　　40. 适当的工作距离的选择，可以得到最好的影像。较短的工作距离，电子讯号接收较佳，可以得到较高的分辨率，但是景深缩短。较长的工作距离，分辨率较差，但是影像景深较长，表面起伏较大的样品可得到较均匀清晰的影像。

　　41. SEM样品若为金属或导电性良好，则表面不需任何处理，可直接观察。若为非导体，则需镀上一层金属膜或碳膜协助样品导电，膜层应均匀无明显特征，以避免干扰样品表面。金属膜较碳膜容易镀，适用于SEM影像观察，通常为Au或Au-Pd合金或Pt。而碳膜较适于X光微区分析，主要是因为碳的原子序低，可以减少X光吸收。

　　42. SEM样品制备一般原则为:

　　A. 显露出所欲分析的位置。

　　B. 表面导电性良好，需能排除电荷。

　　.C. 不得有松动的粉末或碎屑(以避免抽真空时粉末飞扬污染镜柱体)。

　　.D. 需耐热，不得有熔融蒸发的现象。

　　.E. 不能含液状或胶状物质，以免挥发。

　　.F. 非导体表面需镀金(影像观察)或镀碳(成份分析)。

　　43. 镀导电膜的选择，在放大倍率低于1000倍时，可以镀一层较厚的Au，以提高导电度。放大倍率低于10000倍时，可以镀一层Au来增加导电度。放大倍率低于100000倍时，可以镀一层Pt或Au-Pd合金，在超过100000时，以镀一层超薄的Pt或Cr膜较佳。

　　44. 电子束与样品作用，当内层电子被击出后，外层电子掉入原子内层电子轨道而放出X光，不同原子序，不同能阶电子所产生的X光各不相同，称为特征X光，分析特征X光，可分析样品元素成份。

　　45. 分析特征X光的方式，可分析特征X光的能量分布，称为EDS，或分析特征X光的波长，称为WDS。X光能谱的分辨率，在EDS中约有100~200eV的分辨率，在WDS中则有5~10eV的分辨率。由于EDS的分辨率较WDS差，因此在能谱的解析上，较易产生重迭的情形。

　　46. 由于电子束与样品作用的作用体积(interaction volume)的关系，特征X光的产生和作用体积的大小有关，因此在平面的样品中，EDS或WDS的空间分辨率，受限于作用体积的大小。