一、液相仪器发展历史

      从1903年Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文（Tswett在波兰华沙大学研究植物叶子成分时，把碳酸钙粉末装在一个细长的玻璃管中，把从叶子中用石油醚萃取的物质倒在管中的碳酸钙粉末上面，然后用石油醚洗脱被吸附的色素，在管中形成了不同的颜色色带，Tswett当时叫这种色带为色谱，并发表论文到德国植物学杂志上）至今，色谱技术已有近百年的发展历史。特别是60年代现代液相色谱技术的问世，使其在生命科学、药物化学、食品卫生、环境化学等诸多领域得到了广泛的应用。

      在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。经过30多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进，在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多专利技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。

　 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。

      从原理来看，高效液相色谱同经典液相色谱比较，没有很大的区别，主要体现在高灵敏度检测，高压泵和高效固定相填料。在保持高效分离效率，高检测灵敏度和高分析速度前提下，也保持了经典液相色谱的特点：分析样品种类多，流动相多样化和便于制备色谱等特点。高效液相色谱与经典液相色谱比较如下图：

高效液相色谱法与经典液相（柱）色谱法的比较

项目	高效液相色谱法	经典液相（柱）色谱法
色谱柱柱长/cm	10～25	10～200
色谱柱柱内径/mm	2～10	10～50
固定相粒度：粒径/um	5～50	75～600
固定相粒度：筛孔/目	2500～300	200～30
色谱柱入口压力/Mpa	2～20	0.001～0.1
色谱柱柱效/（理论塔板数/m）	2×105～5×104	2～50
进样量/g	10-6～10-2	1～10
分析时间/h	0.05～1.0	1～20

    所以液相色谱特点主要是：

• 高分离度（由于使用高效固定相，分析样品柱效可达到十几万）；
• 高灵敏度（使用紫外检测器可以检测出10^-9g，使用荧光检测器可以达到10^-12g）；
• 高分析速度（一般含量测定的只要几分钟到几十分钟），
• 还有适用范围广，易制备等特点。

 

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分 析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技 术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率 高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。
　　气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合 物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过 气相色谱，位居色谱法之首。

高效液相色谱的类型

　　广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相 色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。

　　通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离 子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表8-1列举了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在 应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。

表8-1 HPLC按分离机理的分类

类 型	主 要分离机理	主要分析对象或应用领域
吸附色谱	吸附能，氢键	异构体分离、族分离，制备
分配色谱	疏水分配作用	各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱	溶质分子大小	高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱	库仑力	无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱	Donnan膜平衡	有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱	疏水分配作用	离子性物质分析
疏水作用色谱	疏水分配作用	蛋白质分离与纯化
手性色谱	立体效应	手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱	生化特异亲和力	蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析

液相色谱仪流程图

　　现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合 起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗 脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。

　　液相色谱仪的工作 过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中 的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。