HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。

溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。

除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。

离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。

在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。

一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。

 

　　1. 为什么要脱气
　　
　　流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中，溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。

 

　　2. 脱气方法
　　
　　目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。

　　超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10～20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。

　　惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。

　　真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。图8-5是单流路真空脱气装置的原理图。一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。

 

 

梯度洗脱装置

　　1. 为什么要进行梯度洗脱？

　　在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。

　　2. 梯度洗脱操作

　　在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。

　　　　
　　线性梯度： 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。
　　
　　阶梯梯度： 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。

　　梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。

　　高压梯度： 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的，其装置结构如图8-6所示。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。

　　低压梯度： 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置，图8-7是四元梯度系统的结构示意图。来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。

液相色谱

液体里含有从大气中吸收的溶存气体。高效液相系统里的溶媒气体会造成输液泵阀门动作不准确，检测基础线的紊乱。如果液体中气泡的含量大，高精度的定压输液也会受到很大的影响。

溶存气泡也会给屈光率，荧光，电化学，紫外线等仪器的检测结果造成误差。

精密分析

使用高精度流量管理的分析的精密仪器，输入分析仪器的试剂，水或其它液体时,如液体中含有气泡会使分析仪器的精度下降。特别是输送的液体如果没有充分脱气，输液泵不能进入最佳工作状态。

脱气原理

流动相在线脱气装置通常连接在溶媒槽和输液泵之间，为在线状态。液体从溶媒槽被输液泵吸入到脱气装置的真空腔。溶液从设在真空腔里的聚四氟乙烯膜管中通过，聚四氟乙烯膜管对液体残存的气体有很高的透气性能。膜管里的溶液进入真空腔后，在真空的状态下，气泡从膜管中被提取出来。从脱气装置出口出来的被脱过气的液体通过输液泵被送到检测器。

一般来说，脱气功率和独立真空腔的聚四氟乙烯膜管内部表面成正比，和液体的流量成反比。
 
(P1) (P2)  输液泵    (PS) 压力传感器

(V1)(V2)  电磁阀    (VP) 真空泵

A: 溶剂             B: 脱气膜管

C: 独立真空腔       D: 阀门

E: 透过膜管         F: 控制器

 

●为避免互相干扰，膜管被设置在独立的真空腔里。

●电磁阀1相互交换排出的气体和大气中的空气，防止真空泵脱气效率的下降，增长了真空泵的使用耐久性。

●电磁阀2在真空泵处于停止状态时由于真空腔处于开放状态，防止了脱气管内流动相的成分发生变化。

●透过膜管当真空泵运转时大气中的气体经过透过膜管和真空腔排出的气体混合后被排出机外。当真空泵停止时真空腔的压力低于大气压力，大气中的气体经过透过膜管和真空腔排出的气体混合后被排出机外。透过膜管中的气体形成的空气层能防止压力控制器的劣化。并且，被吸出的气体能使真空腔里的气体得到稀释后被排出，这样能够延长真空泵的寿命。

●三种型号的脱气装置在美国，德国和日本拥有专利。

●外形和性能不予通知会更改请谅解。

摘自：三和通商株式会社
 

3、液相泵

液相色谱的输液系统主要是用高压输液泵(制备色谱对压力的要求相对较低)，对泵的各项技术指标要求较高。一般最高输出压力应在401~600kg/cm²，流量范围0.1～l0 mL/min。为使对液体流速敏感的检测器能稳定地工作，使色谱定性、定量分析具有良好的重现性，要求泵的输出流量恒定，无脉冲且具有高的流量精度和重复性。

对液相泵的要求：压力平稳，无脉冲，泵体材料耐腐蚀，输出流量稳定，重复性高,输出流量范围宽，泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂，能在高压下连续工作。

泵流量稳定可以降低对脉动敏感型检测器基线噪音的影响，改善灵敏度，降低检测限，使积分更准确，积分结果的可靠性和重现性更好。流量的重现性可改善保留时间和峰面积重视性，使定量结果重现从而获得更高质量的定量结果。

3.1 泵的类型

目前主要液相泵的类型为：恒流泵，包括：注射型泵，往复泵（双泵头往复式柱塞泵和双柱塞往复式串联泵）。

注射泵

注射泵优点是在高输液压力下给出精确的无脉动、可重现的流量；可能过改变电动机的电压，控制电动机的转速，来改变活塞的移动速度，从而可调节流动相流理，使其输出流理与系统阴力无关；流量稳定，操作方便。缺点是泵液缸容积有限，每次流动相输完后，需得新吸入流动相，不利于连续工作。密封性要求高，更换溶剂不方便，价格昂贵。

因此，大多数液相色谱使用的是往复型泵。

柱塞式往复泵：

柱塞式往复型泵工作原理图

隔膜式往复泵：与柱塞式往复泵相似，只是流动相接触的不是活塞，而是具有弹性的不锈钢或聚四氟乙烯隔膜，隔膜经液压驱动脉冲式地排出或吸入流动相，优点是避免流动相被污染。

3.2泵模块的组成

泵模块主要有以下几个部件组成，泵头，主动输入阀，阻尼器，清洗阀，单向阀，混合器等。

主动输入阀

出口单向阀

泵头部分

清洗阀

泵部件

混合器

阻尼器部件
 

3.3 泵梯度淋洗装置

高效液相色谱仪主要有两种梯度模式，一种为高压梯度，一种为低压梯度模式。此时管路的连接方式也不尽相同。

外梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。

内梯度：一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。

低压梯度通过预先设定开启溶剂A,B时间比例电磁阀的运行程序,可控制二元混合溶剂流动相的组成,并连续输出具有不同极性的流动相。该方法可减小溶剂可压缩性的影响,完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化所带来的误差，且仅需一个高压输液泵。

高压梯度是指两台高压输液泵的流量皆可独立控制,可获得任何形式的梯度程序,易于实现自动化。缺点是溶剂的可压缩性和溶剂混合时热力学体积的变化,可能影响输入到色谱柱中的流动相的组成。

二、液相仪器基本构造及原理

1、高效液相仪的构成

高效液相色谱仪主要包括以下部件：溶剂瓶，溶剂瓶箱，在线脱气机，液相泵，（手动）自动进样器（六通阀），色谱柱，柱温箱，检测器。不同的配置可以有不同的模块（如自动进样器恒温器，二维色谱接不同类型检测器等）。

仪器如图示：

液相色谱管路流程为：

依次流程为：（溶剂瓶）流动相→脱气机→液相泵（混合器，阻尼器）→进样器→色谱柱→检测器→废液

2、在线脱气机

脱气机是对溶剂瓶中的流动相进行脱气的，主要包括部件真空泵，传感器，电磁阀，控制器，真空腔等。

主要部件包括以下几个（实物图）

CN、SW开关（调节到连续模式）

传感器

电磁阀

控制器

真空泵

真空腔

脱气机全图

5气路脱气示意图

  一、液相仪器发展历史

      从1903年Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文（Tswett在波兰华沙大学研究植物叶子成分时，把碳酸钙粉末装在一个细长的玻璃管中，把从叶子中用石油醚萃取的物质倒在管中的碳酸钙粉末上面，然后用石油醚洗脱被吸附的色素，在管中形成了不同的颜色色带，Tswett当时叫这种色带为色谱，并发表论文到德国植物学杂志上）至今，色谱技术已有近百年的发展历史。特别是60年代现代液相色谱技术的问世，使其在生命科学、药物化学、食品卫生、环境化学等诸多领域得到了广泛的应用。

      在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。经过30多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进，在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多专利技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。

　 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。

      从原理来看，高效液相色谱同经典液相色谱比较，没有很大的区别，主要体现在高灵敏度检测，高压泵和高效固定相填料。在保持高效分离效率，高检测灵敏度和高分析速度前提下，也保持了经典液相色谱的特点：分析样品种类多，流动相多样化和便于制备色谱等特点。高效液相色谱与经典液相色谱比较如下图：

高效液相色谱法与经典液相（柱）色谱法的比较

项目	高效液相色谱法	经典液相（柱）色谱法
色谱柱柱长/cm	10～25	10～200
色谱柱柱内径/mm	2～10	10～50
固定相粒度：粒径/um	5～50	75～600
固定相粒度：筛孔/目	2500～300	200～30
色谱柱入口压力/Mpa	2～20	0.001～0.1
色谱柱柱效/（理论塔板数/m）	2×105～5×104	2～50
进样量/g	10-6～10-2	1～10
分析时间/h	0.05～1.0	1～20

    所以液相色谱特点主要是：

• 高分离度（由于使用高效固定相，分析样品柱效可达到十几万）；
• 高灵敏度（使用紫外检测器可以检测出10^-9g，使用荧光检测器可以达到10^-12g）；
• 高分析速度（一般含量测定的只要几分钟到几十分钟），
• 还有适用范围广，易制备等特点。

 

　　【讲座内容】
　　三重串联四极杆质谱作为性能优异的检测器，具有选择性好、灵敏度高、通量大等特点，其与超高效液相色谱的联用平台，越来越多地被应用于临床实验室，作为检测复杂生物样本(血液、尿液、组织、唾液等)中多种疾病标志物的首选方案。儿茶酚胺和甲氧基肾上腺素及其在尿液和血浆中相关代谢物作为嗜铬细胞瘤的特异性标志物，近年来成为临床检测热点。
　　本次讲座将系统介绍安捷伦公司从生物样本前处理到分析报告的全流程解决方案，为临床研究实验室提供重要的参考策略。
　　注册报名：http://vote.antpedia.com/index.php?sid=758318&lang=zh-Hans
　　讲座时间：2016年7月26日 上午 10:00
　　主讲人：张政祥，2009年获北京大学理学博士学位，同年6月加入安捷伦科技(中国)有限公司，从事色谱/电泳/质谱在生物制药/制药、临床研究、组学等领域的应用支持工作，在国际期刊发表学术论文15篇，并于2013年美国质谱年会(ASMS)上获邀作oral presentation。
　　讲座结束后，我们将从注册并准时参会者中抽取4名幸运奖，赠送价值50元的京东礼品卡！
　　欲了解更多讲座信息，请加入webinar讨论群：http://www.antpedia.com/?mygroup-282

　　应当注意以下几个问题：

　　(1)样品在流动相中最好是可溶的，如果可能的话，应当用流动相溶解样品，它可使色谱图中低k’段的虚假峰尽可能减少。

　　(2)选择合适的进样阀或注射器。一般说来只要选择适当，都能获得很好的重复性。在选择进样阀时，要考虑它应有较好的清洗条件，并能减少而不是加剧近样过程中通过柱和检测器的紊乱状态。无论使用进样阎还是注射器，部应当尽可能地减小结构和死体积。

　　(3) 为了位监控严密，应当尽可能地选用一种内标，尤其是在遇到复杂样品时，更应如此。

　　(4)如果是单独购买一种进样系统，则一定要保证联接用的固定装置和柱子上的固定装置相配。

　　1) 流动池内有气泡

　　如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状“峰”，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气，检查整个色谱系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的办法除去气泡(最好不连接色谱柱);或者启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开。可反复操作数次，但要注意不使压力增加太多，以免流动池破裂。

　　2) 流动池被污染

　　无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性;如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗、更换窗口。

　　3) 光源灯出现故障

　　紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时，可能产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。

　　4) 倒峰

　　倒峰的出现可能是检测器的极性接反了，改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时，如果组分的折光指数低于流动相的折光指数，也会出现倒峰，这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，无吸收的组分就会产生倒峰，因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化，或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分 析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技 术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率 高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。
　　气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合 物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过 气相色谱，位居色谱法之首。

高效液相色谱的类型

　　广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相 色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。

　　通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离 子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表8-1列举了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在 应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。

表8-1 HPLC按分离机理的分类

类 型	主 要分离机理	主要分析对象或应用领域
吸附色谱	吸附能，氢键	异构体分离、族分离，制备
分配色谱	疏水分配作用	各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱	溶质分子大小	高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱	库仑力	无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱	Donnan膜平衡	有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱	疏水分配作用	离子性物质分析
疏水作用色谱	疏水分配作用	蛋白质分离与纯化
手性色谱	立体效应	手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱	生化特异亲和力	蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析

液相色谱仪流程图

　　现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合 起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗 脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。

　　液相色谱仪的工作 过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中 的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。