1、仪器的检测通量在购买定量PCR仪的时候要根据实验实的需要来选择不同通量的仪器。目前市面上的荧光定量PCR的检测通量小到16个多到384个。如果进行一般的基因表达研究或病原体检测，实在不必购买昂贵的仪器，96孔的通量足够用;需要寻找要新药靶点和疾病标记的实验室可以考虑购买384孔板的仪器。假如经费有限无法购买384孔板仪器的实验室，可以考虑购买运行速度快(带有FAST模块)的96孔板荧光定量PCR仪。有了高通量的仪器，你会发现样品的制备和小体系、多样本的PCR体系构建成为限制实验速度和结果的颈瓶。

　　2、硬件设计特点荧光定量PCR仪主要有传统的96孔板式、创新的离心式等，每种设计都有它的独到之处但也都有无法避免的缺憾。传统的96孔板的荧光定量PCR可以容纳的样本量大，而且无需特殊的耗材。有些传统的96孔板的仪器采用卤钨灯激发、CCD检测，这些光学结构在96孔板的顶部，每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同——边缘效应，对结果产生影响。为了保证精确、准确的实验结果，这类仪器在实验过程中通常会使用ROX(一种荧光染料) 或专用的Reference dye作为参照校正实验结果。卤钨灯的使用寿命短、更换成本较高已经成为很多用户头痛的问题。在实验过程中卤钨灯作为一种热光源，产生较多热能对实验结果有一定的影响。CCD最大的优点就是可以同时扫描所有样品中的荧光信号，但是灵敏度较低，而且同时检测样品间的荧光信号存在干扰。创新的离心式的仪器通常选用LED激发、PMT检测，离心式的设计上避免了边缘效应。LED光源是冷光源对实验没有影响，因此无需采用其他荧光染料校正仪器，而且使用寿命长无需经常更换。PMT每次只能收集单个荧光信号，但是检测灵敏度高。但这类仪器运行速度非常快，但也存在样本量小、耗材昂贵、没有梯度功能、存在时间积分等缺点。随着荧光定量PCR技术的使用，聪明的仪器生产商纷纷在传统的96孔板仪器上大作改进。首先是Stratagene的Mx3000p在检测上突破了使用CCD改用PMT检测荧光信号，大大提高了实验的灵敏度，但激发光源仍然沿用传统的卤钨灯并且没有梯度功能。

　　3、运行速度在荧光定量PCR仪的众多技术参数中，升降温速度也是厂家喜欢大力宣传的指标。更快的升降温，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间，提高PCR的特异性。为了更好的完成实验，各个厂家纷纷推出能快速运行的荧光定量PCR仪。例如ROCHE推出的 Lightcycler2.0利用空气动力学原理，可在半小时左右完成30-40个循环。ABI的7500可以选配FAST模块拥有5°C/秒的升降温速度，可在40分钟左右完成30-40个循环。

　　4、灵活性大规模繁忙的实验室设备固然让人羡慕，但是常规实验室同样可以有精彩的选择。现在的仪器供应商拥有众多技术专家，有的还能提供整个分子生物学的基础研究平台，不但了解、满足您现在的需求，而且还考虑到了你可能变化的需求——升级和更换模块。Bio-rad的Mycycler就可以选择模块升级为定量PCR仪。ABI的7900可以选择将96孔槽变为384孔槽。像离心式的双通道的Rotor-gene3000A 就可以根据您研究的需要升级成四通道的荧光定量PCR仪。

Q1．无CT值（信号）出现
A1．1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Q2．CT值出现过晚
A2.1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。

Q3．标准曲线的线性关系不佳
A3.1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针
4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高

Q4．阴性对照也出现明显的起飞
A4．1.应mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。

Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程
A5．如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。

Q6．熔解曲线不止一个主峰
A6．1．引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
4.模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

Q7．扩增效率低
A7．1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2.反应条件不够优化，可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3.反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

Q8．实验重复性不好
A8．1.加样不准确。
2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。
3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。

Q9．变性温度是否合适
A9．大部分的双链DNA在95°C就开始解链了，在有些情况下在90至94°C都不能很好地变性DNA。由于部分变性，参加反应的探针和引物相应的减少了，因此反应效率会下降。

Q10．变性时间是否合适
A10．15到20秒对于变性扩增子是足够了，然而，长一点的产物，可能会需要30秒，60秒的变性时间通常是不需要的。

Q11．退火温度和时间是否合适
A11．检查引物和探针的Tm值，SYBRGreenI的退火时间大约20到35秒，双标记探针通常是两步法，退火和延伸合并为一步，时间大约是45到60秒，温度通常在60°C，对于FRET探针退火步骤大约20到30秒。

Q12．在哪一步骤采集信号
A12．SYBRGreenI应当在72°C，此时绝大部分的DNA是双链状态，如上所述，双标记探针通常是两步检测，因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。对于FRET检测，数据应该在退火步骤检测。如果对于信号采集点不确定，可以多点采集作对比。如果监控屏幕检测不到信号，检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。

Q13．是否选定了合适的增益值
A13．一些情况下会看到曲线超过了窗口范围，在荧光强度100的地方成一直线。尽管大部分的数据可以用，但是减少增益，一些原始数据就不会超出范围。有时，在第一个循环信号就跳出了窗口范围，这是由于增益选得太高，看起来像没有检测到数据。如果熔解曲线分析时，开始荧光就达到了100，则应当用低的增益重新运行，而不需要重新运行扩增反应，SYBRGreenI和FRET的样品可以在一定程度上反复使用