在对药物进行相应的研究和发现的过程中，药物代谢动力学占据着非常重要的位置，是其重要的组成部分。药代动力学研究主要包括其安全性和有效性，可为临床上的合理用药提供相应的指导。

喜迎国庆，为感恩回馈新老客户的大力支持，美迪西隆重推出国庆档优惠大酬宾活动，内容主要涉及药物筛选的药代动力学服务（非申报）。

促销时间：10月1日至10月31日有效。试验动物种属有ICR小鼠、SD大鼠、Non-naïve比格犬。详情可见药代动力学服务。

放疗可以使癌细胞停止生产，同时如果癌细胞损伤不被修复的话就会死亡，但是一些癌细胞对放射治疗具有耐药性。近日研究者开发了一种新的药物候选物，并在实验模型中发现，该种药物处理过的癌细胞在放射治疗后无法继续生存。不少公司提供生物实验服务中包含有实验模型，实验模型是研究人类疾病机制、治疗、药物评价等不可或缺的条件

实验模型可以通过在比例缩小或等比模型上进行相应的试验，获取相关数据及检查设计缺陷，是生物实验服务内容的一部分。生物实验服务可以为科研人员提供科学实验技术咨询和研发服务。美迪西提供生物实验服务，其在分子生物学、细胞生物学、体外生物学和结构生物学领域有丰富的经验，可以从最初的cDNA文库构建到药物设计，通过蛋白质纯化、结构测定和分析测定，提供一套完整的生物技术服务流程。

肿瘤细胞的能量代谢不同于正常细胞，正常情况下，细胞使用葡萄糖在线粒体内进行氧化磷酸化，而肿瘤细胞能量代谢的特点是活跃地撮取葡萄糖，主要通过有氧糖酵解为细胞的生命活动能力。PFKFB3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases 3 isozyme）的表达会促进葡萄糖的摄入和酵解，所以PFKFB3的异常表达与肿瘤细胞的增殖或凋亡有关。已有研发者发现了癌细胞用于修复DNA的新方式：癌细胞PFKFB3这种蛋白质去修复放疗过程中损伤的DNA。他们发现这个蛋白处于细胞核中DNA损伤的部位，可以调节细胞修复DNA损伤并生存的能力。

基于细胞水平或者动物模型研究发现，PFKFB3在多种肿瘤中都是起促进癌症发生和进展的作用，并且其特异性的抑制剂可以抑制肿瘤的恶化。如研究发现PFKFB3基因与结直肠癌、肝细胞癌有关。

为探讨PFKFB3在结直肠腺癌中的表达及其意义。选取31例结直肠腺癌患者手术切除的癌组织及其对应的癌旁组织标本，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测PFKFB3 mRNA表达，免疫组织化学法检测PFKFB3蛋白的表达，并探讨免疫组化阳性表达率与临床病理参数间的关系。结果发现qRT-PCR结果显示，31例结直肠腺癌组织PFKFB3基因的相对表达量为1.93±1.73，明显高于其相对应的癌旁组织，差异有统计学意义（t=-2.985,P〈0.01）。  

免疫组织化学结果显示，结直肠腺癌组织及其对应的癌旁组织PFKFB3阳性表达率分别为61.3%（19/31）和3.2%（1/31），差异有统计学意义（P〈0.01）。PFKFB3的高表达与肿瘤直径、分化程度、侵袭、转移及治疗前癌胚抗原水平有关（均P〈0.05）。因此PFKFB3对结直肠腺癌具有潜在的临床诊断价值，且与肿瘤的恶性程度存在一定的相关关系。

通过基因表达汇编（Gene Expression Omnibus,GEO）公共数据库，探讨PFKFB3在肝细胞癌中的表达情况，并进一步探索其与肝细胞癌临床病理特征的关系，评价PFKFB3对肝细胞癌术后患者预后评价的意义，预测PFKFB3推动肝细胞癌发展的机制。PFKFB3高表达样本富集了与细胞增殖、抗凋亡、代谢相关的基因集，发现PFKFB3与肝细胞癌多个病理指标相关，且可以做为潜在的判断肝细胞癌患者预后的标志物和治疗肿瘤的靶标。

后来研究人员开发了一个新的药物候选物去抑制PFKFB3这个蛋白质以及癌细胞修复损伤DNA的能力。在实验模型中，这个药物处理后的癌细胞在放射治疗后无法继续生存。此前已知癌细胞中的PFKFB3水平会比正常细胞高出很多，但是关于PFKFB3可以修复放疗产生的DNA损伤还是一个新发现。新抗癌疗法的基础由于正常的健康细胞不会依赖PFKFB3去修复DNA，因此研究人员希望相关的化疗或者放疗联合疗法可以提高病人的耐受性。现在他们的目标就是开发一种药物并奠定基础，使现有的抗癌疗法毒副作用更小。

BE试验在药品研发过程中发挥着非常重要的作用，进行BE试验的目的是证明仿制药品和参比药品生物等效，以桥接与参比药品相关的临床前和临床试验。一般来说BE试验费用较高，因此做好项目管理很重要。项目管理是指在项目活动中运用专门的知识、技能、工具和方法，使项目能够在有限资源的条件下，实现或超过设定的需求和期望的过程，在进行BE试验项目管理时常存在以下几点问题：

1、成本剧增

由于供求失衡，造成国内BE试验费用不断上升，目前一项BE试验费用已增加数十倍。作为医药企业，可以采取两种方式降低成本：（1）采用总价合同外包给CRO公司，可以有效控制成本；（2）多家筛选CRO或试验中心，选择性价比最优者合作，尽量签署长期优惠条款，降低成本。另外，在试验过程中必须杜绝“镀金”现象，防止成本不合理增加。

美迪西生物医药是一家CRO公司，该公司具有符合GLP资质的动物实验室和检测中心，可以用比格犬或食蟹猴等大动物进行动物BE实验，为制剂的优化提供数据支持，降低临床BE风险。

2、研究中心资源少

医药界7.22惨案拉开了国家食品药品监督管理总局推进临床试验数据自查核查工作序幕。“7.22事件”和“一致性评价”引发了医药企业对BE试验需求量的剧增。同时由于核查，部分Ⅰ期临床试验中心被暂停试验或取消资格。造成了有经验的BE试验中心供不应求。另一方面，在政策鼓励下，新的BE机构也如雨后春笋般出现，但新成立的机构经验不足。

针对以上特点，应根据项目难易程度分类筛选中心。简单的项目，如预试验，可委托给新机构。另外，尽量不要把项目委托给新机构作为第一个项目；复杂的项目，如高变异或长半衰期药物，应尽量委托给已有同类试验经验的老机构。筛选中心时，不但要查看硬件设施，更要关注人员配置、项目经验和标准化操作程序（standard operating procedure，SOP）管理体系等软因素，以保证试验顺利开展。

3、专业人员紧缺

由于政策事件导致专业BE试验人员严重紧缺，不论医药企业、CRO还是试验中心都出现了“人才慌”。 作为项目管理者，一定要提前与管理层沟通，在项目开展前招募到有经验的专业人员；若外部招募有经验的人员难度较大，则必须尽快建立培训体系，从内部或应届毕业生中培养BE试验专业人员，解决人员紧缺的问题。

4、项目多，时间少

由于政策导向，BE试验集中爆发，争相赶在政策的截止日期前完成试验，因此进度要求非常高。作为医药企业，应首先对BE试验进行立项评估，优化资源分配，设置项目优先顺序，有序安排试验进度，另外，可采用适当加班或安排多项目同时开展的方法，以达到效果。同时应加强风险管理，提前预防限速环节出现问题，避免进度延期。

5、法规更新快，实际脱节

自从“7.22事件”以来，国家颁布的新法规接踵而至，但实际操作过程中，研究者多忙于试验，无暇学习和采用新法规的要求，造成了实际与法规的脱节。因此作为医药企业，应及时更新和学习法规知识，在试验过程中加强对研究者的培训，及时更正错误操作习惯，保证BE试验符合国家法规要求。

细胞因子多为多肽、蛋白或者糖蛋白，具备良好的抗原性，利用免疫学技术可以方便获得不同细胞因子的抗血清、多克隆抗体或者单克隆抗体。细胞因子检测无论是对免疫学、分子生物学的基础研究，还是对阐明某些疾病的发病机理，指导临床治疗均具有重要的意义。免疫学检测法是细胞因子检测常用的方法之一。

资料表明细胞因子与疾病的病理过程密切相关，细胞因子检测及其基因表达状况的测定正呈上升之势。美迪西不仅可以为客户提供基于Bio-Plex 200、流式CBA、MSD、Luminex系统等全面进行各种single plex或multiplex的细胞因子检测，还建立了一系列相关的免疫学检测平台，用于细胞因子的检测。

1、细胞因子酶联免疫吸附法ELISA检测法

酶联免疫吸附法ELISA是一种特殊的试剂分析方法，它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果判断较为客观，是目前实验室检测抗原抗体最经济、最普遍的试验诊断方法。ELISA法适用于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子的水平。

ELISA基本原理是：

1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化频率很高，故可放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

3）在测定时，将待测抗体（抗原）、酶标抗原（抗体）与固相抗原（抗体）结合形成免疫复合物，经洗涤使免疫复合物与待测抗体（抗原）呈比例，加入酶反应物使其与固相上的酶反应比那的，根据颜色做定性或定量分析，得出检测结果。

2、细胞因子酶联免疫斑点（ELISPOT）检测法

酶联免疫斑点（ELISPOT）检测法是基于定量夹心ELISA法原理，将刺激后的细胞滴加到包被在贴PVDF微孔中，放置于37℃孵育。在孵育的过程中，细胞分泌的细胞因子即会被包被的抗体所捕获，最后用不溶性的酶联底物进行显色，每一个显色点（斑点）代表一个分泌细胞因子的细胞。通过专用的ELISPOT分析仪或在显微镜下进行计数，就可以进行分析。  

ELISPOT法可以在单细胞水平对细胞因子（CK）分泌细胞进行检测。由于是单细胞检测，ELISPOT比ELISA具有更高的灵敏性，能从20万—30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。并且该方法综合了普通ELISA方法的高特异性和准确定量的优点，而且具有生物活性分析得出与功能相关的结果的优点。

3、细胞因子双抗夹心ELISA检测法

双抗体夹心法需制备针对细胞因子不同位点的两个单克隆抗体，先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量。

该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细菌和病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。

4、细胞因子免疫印迹法Western Blot检测法

Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞或者组织样本中的蛋白，经转膜、封闭后目标蛋白与特有性一抗结合，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体起反应，经过底物显色，分析曝光条带的位置和灰度分析获知目标蛋白在样本中的表达情况。

Western Blot法结合了凝胶电泳和固相免疫测定两种技术的高特异性和高敏感性，可以对目标蛋白进行定型和半定量的分析。通过抗原抗体反应对目标蛋白的表达进行半定量检测，还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析。WB作为一种方便可靠的研究工具，将与谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。由于细胞因子分子量比较小，有些用Western Blot进行检测不合适。

免疫学检测法的主要特点是基于抗原抗体反应，反应简单、快速，实验重复性好，大量商业化试剂盒也都是基于这种检测方法。但是，由于仅仅基于分子间免疫学反应，所测得细胞因子含量，并非等同于具备生物学活性的折叠正确的细胞因子，所以，在很多情况下需要借助于生物学检测法最终确定细胞因子生物学活性。

细胞因子作为临床和基础研究的重要生物学分子和检测指标，其生物活性测定方法选择的核心依据是该细胞因子与特定靶细胞在特定培养条件下的反应性。结合免疫学方法对细胞因子含量的初步分析，并通过选取适当的体外细胞培养模型，我们才能获得相对准确的细胞因子的生物学活性指标。

5、细胞因子免疫学检验法常见问题总结：

（1）ELISA 试 剂 盒 主 要 有 哪 些 试 剂 ？

ELISA 试剂盒中主要有

1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；

3）酶的底物；

4）标准品；

5）结合物及标本的稀释液；

6）洗涤液；

7）酶反应终止液。

（2）造成ELISA测定结果不正常的因素主要有：

1）标本因素：样本需新鲜采集，防止污染，且准确稀释至适当的倍数。

2）试剂因素：ELISA试剂盒在保质期内，其他试剂如蒸馏水的水质等。

3）操作因素：注意操作细节，如加样不可太快，避免加在孔壁上；洗板过程中注意洗液不能溢出孔外；显色要注意控制时间等。

（3）ELISA 试剂盒（96 孔规格）一般可以进行多少个样本的检测？

标准品孔和待测样本孔需进行复孔操作以保证数据的可信度。每次需将标准品按照7-8个梯度稀释以制备准确的标准曲线。一次96孔板实验可以进行20-25个样本的检测工作。

（4）抗体使用有哪些注意事项？

使用抗体前需仔细阅读说明书，了解抗体的保存条件以及不同用途下的推荐稀释比例。较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，要注意相同质量下低浓度的抗体体积反而更大。

（5）什么是WB的灰度半定量分析？

通常用Image J 或photoshop软件对各个样本的目的蛋白及其内参蛋白曝光后胶片的灰度值进行计算，按照灰度值的高低来半定量分析各个样品中蛋白的表达差异。

杜仲是国内特有的药用物种，经常作为临床使用，一般都是使用皮入药。对杜仲皮和杜仲胶颗粒中的蛋白进行了分离和蛋白纯化，为杜仲中的生物活性成分和药理研究提供了手段。但是杜仲中的很多化合物的结构和性质特别相近，因此其有效成分的提取和分离存在一定困难。

蛋白表达纯化是一项广泛应用于生物技术、生命科学和医药等研究领域的技术，用于重组蛋白表达的宿主细胞通常来源于原核细胞、哺乳细胞、昆虫细胞和酵母细胞等蛋白表达系统。美迪西提供蛋白表达服务，拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系，以提高客户的目的蛋白表达水平。

1、杜仲的蛋白分离研究

用凝胶层析、反相高效色谱层析等分离纯化方法，从杜仲树皮中分离到分子量为4.16的一个新杜仲抗真菌蛋白，并进行了蛋白纯化。

（1）用SDS-PAGE方法从杜仲胶颗粒中分离到分子量约为14、16、18、22、24、28、30、32和55 kDa的9个杜仲胶颗粒结合蛋白。用液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)技术，鉴定了4.16、4.2、8.3、16和18 kDa蛋白序列，获得14个肽片段。在抗菌肽数据库(APD)中对这14个肽片段进行结构分析、抗菌活性预测和序列比对，结果显示有11个肽片段具有抗菌肽典型结构。

（2）纸片法对EAFP3进行体外抗菌活性检测，抑菌活性检测结果表明:EAFP3可抑制酵母、酵母类真菌、霉菌和植物病原真菌的生长，EAFP3对白色念珠球菌、黄曲霉、番茄灰霉病菌的IC_(50)值分别为31.25、31.25和62.5μg/mL。EAFP3对高温有一定耐受性，在100℃加热30 min仍有显著抑制活性；可适应较宽pH范围，在pH从5.8-8.0范围内都有显著抑制活性。该研究结果可能为创制新型生物农药和生物药物提供了先导化合物信息，为克隆编码杜仲抗菌蛋白的基因提供了引物和探针设计序列。

2、杜仲的药理研究

（1）抗肿瘤作用

现代药理实验证明杜仲有抗癌和抑癌之功效，其有效成分与其杜仲所含的木脂素、苯丙素及环烯醚萜类化合物有关。如研究者从杜仲叶氯仿提取物中分离出的地普黄酮，是一种干扰T淋巴细胞功能的免疫抑制物质，对人鼻咽癌(KB)和鼠淋巴细胞白血病(P388)均有生长抑制活性。杜仲具有兴奋垂体-肾上腺皮质系统、增强肾上腺皮质功能的作用。

（2）降压作用

杜仲的降压作用是经过多年临床证实的，现代药理研究试验有效地揭示了这一作用的机制。实验证明，杜仲水提物对犬有明显的降压作用，而且疗效平稳、无毒、无副作用。

（3）对免疫系统的影响

给小白鼠腹腔注射杜仲叶的20%和50%的乙醇提取物，可明显增强小白鼠脾淋巴细胞转化功能及腹腔巨噬细胞的吞噬功能，而对正常小鼠脾抗体形成细胞无明显影响。热水泡杜仲茶提取物用1%NaOH冻结，干燥后得到的碱性物质为含糖醛酸的酸性多糖类，该碱性物有抗破坏人体免疫系统病毒的功能，有可能用于预防和治疗艾滋病。

（4）抗衰老作用

杜仲能增强机体的非特异性免疫功能，对细胞免疫具有双向调节作用，提示杜仲具有抗衰老作用。现代研究发现，杜仲水提物能抑制乙二胺四乙酸、H2O2、维生素C等对脱氧核糖、DNA造成的氧化损伤。

（5）骨细胞增殖作用

杜仲的水提液及水提液的不同萃取物和UMR106成骨样细胞体外共同培养，结果显示，水提液具有最强的促进细胞增殖作用，其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对细胞增殖有一定的促进作用，而萃取后的剩余水层仍保留与原水层相似的促进细胞增殖作用，表明杜仲中极性大的部分可能含有直接作用于成骨细胞的活性成分。

（6）其他作用

杜仲水煎剂对结核杆菌、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、炭疽杆菌有抑制作用。杜仲叶的各种麻醉犬均有利尿作用，且无快速耐受现象，对正常大鼠和小鼠也有利尿作用。杜仲的利尿作用与桃叶珊瑚甙有关，该成分能刺激副交感神经中枢，加快尿酸转移和排出，利尿作用明显。此外杜仲还有利胆作用、降血脂作用、保胎作用、增强肌肉作用、中枢抑制作用等。

总之，杜仲具有广泛的药理作用，其应用前景广阔，在医药领域具有巨大的潜力。