固定化金属离子亲和色谱用于蛋白质及肽的分离分析

摘要：固定化金属离子亲和色谱（IMAC）作为一种新型高效色谱分离模式，已经被广泛应用于蛋白质的分离分析。IMAC常作为捕获/释放柱，富集某一类肽段或蛋白质，以及含有组氨酸标签的重组蛋白的分离纯化。由于IMAC材料对于样品的分析能力相对较弱，经过IMAC柱分级后的组分仍然十分复杂，因此，通常需要对这些组分进行进一步分离。针对这一问题，本文发展了一种可重复使用的高效IMAC 柱，并将其用于（一维及二维）高效液相色谱的分离。

Analytical Separations of Proteins and Peptides Using Immobilized Metal Affinity Chromatography

Patrick McCarthy, Mark Tracy, Terry Sheehan, and Christopher Pohl

Abstract：Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) is a well-established protein separation technique experiencing expanded use based on new, high-performance analytical phases. IMAC is commonly used in capture/release cartridges for enriching peptides and proteins of a certain class or Histagged recombinant protein purification. Due to the relatively high resolution of these cartridges, fractions collected from the cartridges can still be quite complex, and further purification is generally required. To address this limitation, a reusable, high-resolution IMAC column that can be used for high-performance (1-D and 2-D) LC separations has been developed.

        基于新型、高性能的固定相的固定化金属离子亲和色谱（IMAC）是一种信誉卓著的蛋白质分离技术，近来受到广泛的关注。IMAC 常作为捕集柱，用于富集某一特定类型的肽段或蛋白质（如表面含有裸露的组氨酸残基或磷酸化的肽段/蛋白质），以及含有组氨酸标签的重组蛋白的分离纯化。由于IMAC 的分离柱效相对较低，经过IMAC 柱分级收集的组分仍然相当复杂，通常需要对其做进一步纯化处理。针对这一问题，本文发展了一种可重复使用的高效IMAC 柱，并将其应用于（一维和二维）液相色谱的分离分析。

        在本文中所设计的ProPac^® IMAC-10（Dionex Corp., Sunnyvale,CA）固定相能够使蛋白质分子与固定相表面的纳米粒子产生一对一的相互作用。通过这种方式，可以将预富集的蛋白与基质中的其他组分（如蛋白质、肽段、DNA 等）分离，同时也与相邻的纳米粒子所结合的组分分离。从概念上讲，这种设计非常适于某一类蛋白质或肽的分离，柱上复性、柱上蛋白质与蛋白质的相互作用研究以及柱上定位反应（如定位生物素标记）。本文举例说明了ProPac IMAC-10 对蛋白质及肽的分离能力。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

        实验所使用的试剂包括：氯化钠（Fluka,Milwaukee，WI）；咪唑（Fluka）；尿素（Sigma, St. Loui s, MO）；乙腈（Burdick &Jackson, Morris Township, NJ）；去离子水，阻抗18MΩ?c m ；三氟乙酸（TFA）（Pierce Chemical, Rockford, IL）；十水合焦磷酸四钠（TSPP），Na₄ P₂O_7^-10H₂O（Sigma）；甲酸，
98%（EM Science, Gibbstown, NJ）；冰乙酸（J.T.Baker, Phillipsburg, NJ）；氨水（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）；六水合三氯化铁，FeCl_3^-6H₂O（Aldrich, Milwaukee, WI）；β -酪蛋白（Sigma）；2mm × 50 mm 和4 mm × 250mm ProPac IMAC-10 柱，以及4.6 mm × 150 mmAcclaim 300 C18 反相色谱柱（Dionex）。

1.2 仪器

        色谱分离在Dionex 高效液相色谱系统上完成，其配置包括：AD20 检测器、GP50 泵、AS50自动进样器以及Chromeleon 色谱工作站。最终的实验仪器在配置了P680 DGP6 泵、TCC-100 柱温箱、ASI-100TTM 自动进样器、UVD 340U 检测器以及Chromeleon 色谱工作站的二元梯度高效液相色谱系统上完成。

2 结果与讨论

2.1 IMAC 的机理

        采用IMAC 进行蛋白质分离主要基于其配位作用。对于IMAC- 铜色谱柱，暴露于基质表面的铜离子提供配位受体位点，能够与蛋白质表面裸露的组氨酸残基结合。用其分析核糖核酸酶A、肌红蛋白和碳酸酐酶的晶体结构，其表面裸露的组氨酸数目分别约为4，9，15 个。这些蛋白质通过增加流动相中咪唑浓度的梯度洗脱模式实现分离（见图1）。

2.2 带有组氨酸标签的蛋白分离（IMAC-Cu）

        利用组氨酸标签与IMAC 柱的作用，IMAC柱可用于重组蛋白的分离纯化。分离通常包括三个步骤：首先，在特定的结合缓冲溶液条件下进行蛋白的上样和捕集；淋洗去除杂质；最后，洗脱富集的蛋白组分。通常，经过IMAC 柱纯化后的蛋白，其纯度不足以结晶及进行其他重要的活性测定。但是，ProPac IMAC-10 柱对于含组氨酸标签的蛋白质具有非常强的纯化能力，可以用于杂质的检测及去除（见图2）。

2.3 单克隆抗体的分离（IMAC-Cu）

        当一个单克隆抗体（Mab）的变体数目增加时（如氧化、脱酰胺作用、赖氨酸切断、唾液酸化、聚合等），样品的非同源性也随之增加。目前，用于Mab 变体分析的方法主要有阳离子交换、阴离子交换、疏水作用色谱（HIC）、体积排阻色谱（SEC）等模式。由于样品的变体十分复杂，因此有关变体的分离以及定性分析，通常需要多种色谱分离模式联合，结合木瓜蛋白酶或胰蛋白酶水解来实现。键合铜离子的ProPac IMAC-10 柱同样适合上述物质的分离分析。图3a 表示完整的单克隆抗体的分离，图3b 为10 倍放大的结果。ProPac IMAC-10 能够去除Mab 主峰上的未知杂质。若使用木瓜蛋白酶酶解，ProPac IMAC-10（Cu）能够从Fc 碎片中分离出Fab 碎片（数据未给出）。

2.4 磷酸化肽的分离（IMAC-Fe）

        以β - 酪蛋白为标准蛋白说明ProPac IMAC-10 柱在键合铁离子模式下的作用。β - 酪蛋白经胰蛋白酶水解后， 得到单磷酸化肽（FQSpEEQQQTEDELQDK）和四磷酸化肽RELEELNVPGEIVESpLSpSpSpEESITR）。键合铁离子的ProPac IMAC-10 柱所使用的流动相与反相色谱流动相兼容（TN705）。在本实验中，二维分离在Dionex 二元梯度高效液相色谱系统上自动完成，自动的IMAC 富集以及反相分离的色谱结果如图4 所示。图4a 与图4b 分别给出了在ProPacIMAC-10 柱上不保留的痕量组分及其反相分离的结果，图4c 与图4d 也给出了在ProPac IMAC-10柱上保留组分的洗脱及其反相分离的情况。单磷酸化肽和四磷酸化肽分别在5.8 和9.2 min 被洗脱（见图4d）。

3 结论

        ProPac IMAC-10 分析柱为复杂生物样品的分离提供了一种强有力的工具，具有可重复使用、强大的常规分析能力以及高效的蛋白质分离能力等特点。由于该柱适宜于高压分离，因而能够在提高流速及高通量条件下使用。通过键合不同的金属离子，可以实现不同分离的需求，而且金属离子种类可以进行更换。由于该柱支持进行多次进样，无须重新固载金属离子，因此非常适用于自动化分析，能够以不同形式满足高效液相色谱及快速蛋白液相色谱（FPLC）分析的需要。

Additional Reading

Automated enrichment and analysis of phosphopeptides using immobilized metal affinity and RP chromatography with column switching. Tech.Note 705, LPN 1763. Dionex Corp., Jan 2006.

Separation of an intact monoclonal antibody and fractionation of monoclonal antibody papain digest fragm ents using immobilized metal affinity chromatography. Appl. Note 177, LPN 1840. Dionex Corp.