DNA 和蛋白质电泳分离的定量荧光分析

摘要：在生命科学领域中，UV透视法是一种广泛使用的工具。许多用于蛋白和核酸电泳分离后染色的荧光染料在UV区域内有着显著的激发峰，因此中等范围的UV 波长成为大多数用于高灵敏分析的荧光素的激发波长。然而由于通过UV光盒表面的光照度缺乏均一性，定量分析往往受到限制。这里介绍的光照系统通过使用可以提供通过成
像表面的变化系数（CV）<6％的光照均一性的电子稳定器和可调的磷涂层，发展了一种高强度的光照体系。该体系可以专门解决上述问题。

Quantitative Fluorescent Analysis of DNA and Protein
Electrophoretic Separations

Sean R. Gallagher

Abstract: UV transillumination is a widely used tool in life science research. Many fluorescent stains used in postelectrophoretic protein and nucleic acid analyses have significant excitation peaks in the UV region, making mid-range UV the excitation source of choice for high-sensitivity analysis of most fluorophores. However, often quantitative analysis is limited by the lack of uniformity of the illumination across the surface of the typical UV light box. The transilluminator described here has been designed specifically to address this issue through the development of a high-density lighting system using an electronic ballast and a tuned phosphor coating, which provide uniformity of lighting of <6% coefficient of variance (CV) across the imaging surface.

        在生命科学研究领域中，UV 透视法是一种普遍使用的工具。几乎没有例外，许多用于蛋白和核酸电泳分离后染色的荧光染料在UV 区域内（300~350nm）有着显著的激发峰，因此中等范围的UV 波长成为大多数用于高灵敏分析的荧光素的激发波长。然而由于通过UV 光盒表面的光照度缺乏均一性，定量分析往往受到限制。此篇应用性文章详细地描述了具有高度均一性的302nm UV 透视系统，FirstLight^TM UV 光照装置（UVP, Inc., Upland, CA）(见图1)。它通过发展一种使用电子稳定器和可调磷涂层的高强度光照体系，可以提供通过成像表面变化系数（CV）< 6 ％的光照均一性。从而使采用UV 光照系统进行定量和重现性地分析分离蛋白质和DNA 成为可能。

CCD成像与UV 光照系统

        如今，在生物研究实验室中，针对相关生成文件和电泳分离分析的数码荧光成像技术发展十分迅速^[1]。其应用囊括了蛋白和DNA 凝胶相关文件的生成和分析^[2~5]。随着冷却的低光强和高分辨电荷耦合设备(CCD)照相机^[1]的引入，CCD 捕获技术已经成为一种可替代基于激光扫描方法的诱人的技术。

        数码荧光CCD 成像有许多优点，包括： 

• 相对于激光扫描成本低
• 检测灵敏度高
• 动态范围宽
• 低噪音CCD 照相机捕获信号速度快（通常从ms 至s）

        对于蛋白和核酸的分析有很多高灵敏的染料。几乎没有例外，许多用于蛋白和核酸电泳分离后染色的荧光染料在UV 区域内有着显著的激发峰，因此中等范围的UV 波长成为大多数用于高灵敏分析的荧光素的激发波长^[5]。

        蛋白质的快速荧光多元分析（从单块凝胶中获得若干荧光信号）大大地简化了在一维或二维十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，蛋白表达、转录和转译后的修饰分析^[4,5]。

        然而由于常用UV 透视系统均一性的缺乏，通过紫外可见CCD 成像进行定量便成为一个难题。精确重现的UV 成像需要均一稳定的光源。

        均一的光照系统对于定量分析非常重要，它能够保证：

• 穿越光照表面始终如一的灵敏度和动态范围
• 很少或不依赖可以导致低信号数据丢失的均一性校正软件
• 直接进行胶之间的对比

UV光照系统的表征

        通过CCD 直接成像的强度轮廓、UV 传感器探测光照系统表面的轮廓以及使用染色的经电泳分离的样品,可以对FirstLight 光照系统进行表征。

        成像捕获方法需要使用以下产品：AC1 AutoChemi 暗房，与FirstLight UV 光照系统相对的8W 光照体系，BioChemi 冷却12 位CCD 照相机，LabWordsTM 4.5 软件（均来自UVP，Inc.）。将8.5mm.1:1.5 电视透镜安装到BioChemi 照相机上用于捕获影像。曝光调至150ms（进仓调至4），光圈调至能够给出全范围的信号。计算的CV 适合整个滤光器表面（全部区域）和距每个边缘处1cm 的区域（内部区域）^[6]。

        由于独立地直交地测量均一性，我们将带有UV 探针的光照系统安装于X-Y 轴平台上。该平台可以在整个表面区域移动，在整个滤光器表面指定的位置获取数据。光圈圆锥体安装在一个带有300nm 传感器的UV 仪上。整个组合再安装到X-Y 轴平台上，光圈到滤光器表面的距离为1mm。X-Y 轴平台按设定的程序在光照系统滤光器的表面移动，分别在每100个均等的空间点上停留3s。在每一个点处，仪器将会测量UV 强度， 并且输出到Excel (Microsoft, Redmond, WA)中计算CV。

        FirstLight 光照系统是一种高度均一的激发光源，可用于很宽范围的基因组与蛋白组的定量荧光成像分析，包括：

• 电泳分离和蛋白质的一维二维电泳的定量
• DNA 定量
• RNA 定量该系统使得定量UV 多谱段的荧光CCD 成像成为可能。

参考文献

1. Medberry S, M o o m a w B , Gallagher SR. Digital electrophoresis analysis. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons 2004.
2. Gallagher SR. One-dimensional SDS gel elec- trophoresis of proteins. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons 2003.
3. Gallagher SR, Winston SE, Fuller S, Hurrell JGR. Immunoblotting and immunodetection. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons 2004.
4. Patton WF. Detection technologies in proteome analysis. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci 2002; 771(1-2):3-31.
5. Haugland RP. Handbook of fluorescent probes and research products. Eugene, OR: Molecular probes, 2003.
6. Steele RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics, 2nd ed. New York: McGraw-Hill Book Co., 1980.
7. Sasse J, Gallagher SR. Staining proteins in gels. In: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al., eds. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons, 2003.