傅里叶变换红外光谱法检测蛋白质的稳定性

摘要：在储存和处理过程中，蛋白质的降解是生产和研究中的一个重要问题。要想解决这一问题，并不需要对蛋白质结构进行详细分析，只需要简单、快速地判断蛋白质“好”或“坏”即可。如果对数据的采集加以关注，傅里叶变换红外光谱（FTIR）就可以便捷地给出这种判断。本文系统地阐述了傅里叶变换红外光谱在相关应用方面所面临的挑战、局限性和潜力，并以牛血清白蛋白由于温度引起的变性为例加以说明。

Abstract：Protein degradation during storage or processing is a major concern in both manufacturing and research. Generally a detailed structural analysis is not required; a simple“good/bad”determination is all that is needed. When proper care is exercised in the data collection, Fourier transform. infrared spectrometry can provide this information. The challenges, limitations and the potential usefulness of FTIR for this kind of determination are outlined, and an example is provided involving the temperature-induced changes in bovine serum albumin.

1 前言

        在储存和处理过程中，蛋白质的降解是生产和研究中的一个重要问题。要想解决这一问题，并不需要对蛋白质结构进行详细分析，只需要简单、快速地判断蛋白质“好”或“坏”即可。如果对数据的采集加以关注，傅里叶变换红外光谱（FTIR）就可以便捷地给出这种判断。本文系统地阐述了傅里叶变换红外光谱在相关应用方面所面临的挑战、局限性和潜力，并以牛血清白蛋白由于温度引起的变性为例加以说明。

2 蛋白质的表征

        蛋白质可以用四级结构来表征：一级结构--蛋白质肽链的氨基酸序列；二级结构--肽链中的规则区域；三级结构--规则和不规则区域的折叠；四级结构--多肽链的空间组合。一个蛋白质分子中所有氨基酸的酰胺键皆相同，但是每一个氨基酸残基所处的分子状态取决于其在结构中的位置，特别是二级结构。蛋白质分子中，空间上相邻的氨基酸可以通过氢键作用形成二级结构，例如α - 螺旋、β - 折叠、β - 转角和无规则卷曲。

        在红外线照射下，分子中的化学键可以被激发，从而产生振动。对于二级结构为什么会影响分子的红外光谱和拉曼光谱，已有文献详述^[1]。简而言之，分子所处的状态（例如氢键结合）就像吉他的调音柱所起的作用一样，会轻微地改变分子中化学键的振动频率。很多文献论述了氨基酸振动频率和各种二级结构之间的关系^[2]。尽管这些方法都有一定的局限性^[3]，但是蛋白质结构会影响其红外光谱的事实却得到了很好的证明。

        蛋白质中令人感兴趣的振动主要是酰胺Ⅰ带的伸缩振动（大约在1650 cm-1），由酰胺基团O=C-N 产生，其中的氧原子和氮原子都会生成氢键。这样就可以依此推断二级结构对分子振动的影响。遗憾的是，液态水和气态水在这一区域也有振动，消除这两种干扰是蛋白质红外光谱分析所面临的最大挑战。

        已经发展了一些避免水峰干扰的方法。向红外光谱仪中通入氮气或者干燥空气以去除水蒸气，或者采用数码手段处理数据皆是消除水峰干扰的有效途径。吹扫等物理的去除方法应优先考虑，因为任何的数字处理都会使分析结果偏离原始数据。使用D₂O（氘的振动相对酰胺Ⅰ带有一定的位移）作为溶剂来去除水峰的效果很好，但是这一方法费用昂贵，而且不方便。

        上面这些问题在图1 和图2 中得到了很好的例证。图1 是水相缓冲液中牛血清白蛋白（BSA）、水蒸气和缓冲液的光谱图，以及BS A 与缓冲液的光谱图的差谱图，所有的谱图坐标相同（已扣除背景）。蛋白质的信号很小，相对于缓冲液的1.5 个单位的吸光度，蛋白质只有0.02 个单位的吸光度，而且与水峰的交叠非常明显。

        图2 证明了不同温度对水峰的影响。在对蛋白质稳定性进行研究时通常比较关注温度的影响，但是在扣除缓冲液光谱的过程中，如果缓冲液光谱图在室温下测得，而蛋白质的光谱图是在其他温度下测得，由于水峰的位移和峰形的改变，会让得到的结果毫无意义。

3 实验部分

        将牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）溶解在Tris 缓冲液中（0.05 mol/L Tris, 0.05 mol/LNaCl, 0.0005 mol/L 乙二胺四乙酸［EDTA］，pH7.2），质量浓度为4mg/mL。Nicolet^TM 6700 红外分光光度计（Thermo Electron Corp．，Madison，WI），中红外光学系统（KBr 分束器，氘化三甘氨酸硫酸脂［DTGS］检测器），配套的Proteus 蛋白质分析模块。温度控制附件用干燥空气吹扫过夜。样品装在6- μm通路长度的样品池中，窗口材料为CaF2。Proteus分析模块提供的@Temp^TM 部分用来收集光谱数据，从5 ℃到80 ℃，每5 ℃一个台阶。每个温度台阶有5 min 的平衡时间，256 次扫描，4 cm-1的分辨率。OMNIC^TM 光谱软件用来分析和处理数据，包括峰特征解析。Proteus 分析模块的使用手册^[4]中提供了优化实验和分析的必要信息。结果最后输出到Microsoft Excel 中做最后处理。

4 结果和讨论

        温度升高可以引起氢键断裂。由于蛋白质的二级结构靠氢键作用形成，因此氢键的断裂可以引起蛋白质的微小或者可能是彻底的结构变化。这种改变将会使蛋白质的功能丧失。

        牛血清白蛋白是血液中一种脂肪酸和其他非水溶性物质的转运蛋白。这种蛋白有54% ~ 68%的α - 螺旋^[5]，剩下的是转角和无规则卷曲（无β - 折叠）。与其相似的人源蛋白（HSA）呈心形的3D结构，至少有5个转运脂肪酸的“沟槽”。

        图3 给出了牛血清白蛋白在高温和低温下的光谱图，即使不作进一步的分析，也可以看出变化非常明显。有很多方法可以从中提取有用的信息。分析方法的选择取决于使用者是想获得简单的定性信息（蛋白质是否变质）还是欲获得蛋白质二级结构的详细信息。

        首先， 使用例如曲线拟合的光谱分析技术，用文献^[4]中所提供的相关度表格，可以提取特定蛋白质二级结构相关的信息。用这种方法处理BSA 的光谱图，结果见图4。在这之前，需要选择已知结构的蛋白质作为参考，确定合适的拟合参数和变量。拟合峰的峰面积与各种螺旋、折叠的“浓度”成比例，因此可以计算出各种二级结构所占的百分比。

        另外，可以把蛋白质的光谱图同数据库中已知的各种二级结构所占百分比的蛋白质图谱进行比较。包含相关蛋白质信息（例如：α - 螺旋，β - 折叠的含量）的红外光谱数据库，可以用化学计量学程序包，例如TQ Analyst 软件（Thermo Electron Corp．）来建立。不管用哪一种化学计量学方法，结果的可靠性取决于所输入数据的可靠性。必须有足够的有关二级结构信息，才能最大限度的保证模型的适用性。可以采用多种算法（例如偏最小二乘法）来计算，建立普适的方法。

        采用一种简单的方法就可以研究蛋白质的降解。这里，我们仅建立一个感兴趣的蛋白质的数据库，其中一些目标参数，例如反应产率、酶活性等按标准状况下设定。只要和数据库中的图谱进行对照，就可以直接预测蛋白质性质的变化情况。图5 是运用化学计量学方法处理BSA 数据的结果。通过曲线拟合可以计算出α - 螺旋的含量。数据利用TQ Analyst 软件进行交互确认。良好的相关度表明数据具有很好的内在一致性，以及在蛋白质性质预测方面的良好前景。

        蛋白质的相关度表和化学计量学分析必须谨慎使用。一些蛋白质，例如聚-L - 赖氨酸，其表现和大多数的蛋白质不同。Jackson 和Mantsh^[3]讨论过有关错误使用红外光谱的问题，并且建立了相关分析的限定条件。总之，评价蛋白质的变性很容易，但是不可能给出绝对的构象变化信息。

5 结论

        FTIR 在快速、简单地提供有关水溶液中蛋白质质量控制信息方面有很大的潜力。通过一系列标准化处理过程，获得的数据可以显示处理过程中蛋白质是否变性，而不用通过结晶或是浓缩的方法测定。数据分析所用的方法取决于想获得哪一方面的信息，对于特定蛋白质或许需要专门设计的方法测定。Proteus 分析模块对于不熟悉FTIR 的使用者来说也很容易操作。

参考文献

1. Bradley, M. Thermo Electron Corp. Application Note AN 50733, “Curve Fitting in Raman and IR Spectroscopy: Basic Theory of Line Shapes and Applications”; 2004.
2. Oberg, K.A.; Ruysschaert, J.-M.; Goormagtigh,E. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 2937-48.
3. Jackson, M.; Mantsch, H.H. Crit. Rev.Biochem. Molec. Biol. 1995, 30(2), 95-120.
4. Bradley, M.S.; Nishikida, K. Infrared Measurements of Proteins: Theory and Applications.
   Booklet included in Proteus protein analysis kit (not available separately), 2005.