原位杂交、PCR技术、新一代测序技术之不同

肿瘤靶向药物被用于临床，靶向治疗催生了靶向诊断，因此一批用于检测靶向治疗药物靶点的分子病理技术迅速问世，一些原位杂交公司也提供了分子病理学技术服务，本文主要从核酸突变分析方法来总结荧光原位杂交技术、PCR技术、新一代测序技术这3者的不同。

1、荧光原位杂交FISH

原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。荧光原位杂交FISH是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。美迪西生物医药提供原位杂交技术服务。

荧光原位杂交FISH是应用荧光素标记的探针与组织细胞中待测核酸反应形成杂交体，并采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察信号表达。为了同时检测多个靶位，在荧光原位杂交技术的基础上发展起来一种新技术，即多彩色荧光原位杂交。它用几种不同颜色的荧光素单独或者混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个基因，扩大了FISH技术的临床应用。

FISH技术目前主要应用于染色体和DNA水平上的病理诊断检测，染色体FISH主要检测染色体易位、缺失、重复、变异等；DNAFISH主要是检测基因突变、扩增、易位、缺失。与原位杂交技术相比，FISH更加安全、快速，特异性好、定位准确。

2、PCR技术

PCR技术是目前应用最广泛的DNA分子检测技术,它是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法。其原理是设计特异引物，在TaqDNA聚合酶催化作用下，经过高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复循环，对某一特定模板的特定区域进行扩增，反应结束后应用凝胶电泳或测序等方法分析产物。因此，该技术可以直接检测疾病组织、细胞中是否存在某种病毒DNA，同时PCR技术还是基因突变检测的前期必备技术。

与杂交技术和测序技术相比，PCR技术优势主要在于、高敏感度、易于推广。其主要局限在于多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限。

3、新一代测序技术NGS

NGS是一种高通量检测DNA和RNA变异的方法，与Sanger测序不同，NGS可检测多种样本，且可以同步提供大量的基因变异信息，因此该方法非常适合于并行检测和分析多种基因和变异信息。没有一种方法是完美的，由于背景信号干扰、酶的扩增错误率、化学反应不彻底等问题，所有的NGS平台都有一定的内在错误率。而测序过程中的错误会增加突变检测的难度，特别是低频突变。

PCR由于灵敏度高，操作简便快捷是近年来应用比较多的基因诊断技术，但PCR诊断技术的假阴性和假阳性的比例较高，对同一样本也只能作一次分析，不能重复实验结果。随着探针技术的不断发展，FISH目前的灵敏度已经接近或达到PCR的水平，并能很好弥补PCR技术的局限。FISH技术不仅有极低的假阳性、假阴性的比例，还能对同一样本进行多次的FISH操作以及利用不同颜色的荧光探针一次检测多个染色体或基因的异常，大大节省了检测的时间。此外，通过FISH可以对染色体或特定基因的数目异常，特定片断的缺失、易位和重排进行诊断研究。