黑色素瘤小鼠肿瘤模型的建立及中药治疗研究

在肿瘤病因、发病机制研究和抗肿瘤药物研发中使用小鼠肿瘤模型，能够很好地复制人类疾病，也是肿瘤研究的主要途径之一。黑色素瘤是常见的恶性肿瘤疾病，具有恶性程度高、病情发展快、预后差等特点，严重威胁着人们的生命健康。中医在我国的医疗历史上源远流长，在黑色素治疗上也取得了一些成就。中药成分抗黑色素瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，其在抑制黑色素瘤血管生成、DNA的合成以及增强肿瘤转移抑制基因的表达等方面有显著作用。

目前小鼠肿瘤模型按照建立方式可分为自发和诱发小鼠模型、异种移植模型、转基因小鼠模型、基因敲除小鼠模型、可调变的小鼠肿瘤模型5类。美迪西可以根据客户的需求提供各种有效的动物模型，用来检测药物的有效性。实验动物有非人类灵长动物、狗、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、裸鼠等各种种类。目前，其已经建立多个有效动物肿瘤模型，并经过多方验证和长期实践考验。在黑色素瘤的小鼠肿瘤模型的建立中，由于B16黑色素瘤是发生于C57BL/6小鼠耳根部的一种自发性肿瘤，因此是肿瘤研究的常用实验模型之一。

1、黑色素瘤小鼠肿瘤模型的建立研究

为了快速有效地进行在体药物筛选，研究了以小鼠黑色素实体瘤组织中的原代细胞构建黑色素瘤小鼠肿瘤模型的方法。黑色素瘤B16是 C57BL/6小鼠耳根部自发出现的肿瘤，将黑素瘤细胞通过皮下、静脉或腹腔接种的形式注入受体小鼠体内可以构建相应的黑色素瘤动物模型。从荷黑色素瘤小鼠的组织中提取原代肿瘤细胞，与体外培养的B16细胞通过皮下注射分别植入两组C57BL/6小鼠体内，考察两组小鼠肿瘤显现时间和生长速度。

结果表明当接种浓度为5.0×10⁶个/mL、每只0.2mL时，小鼠黑色素瘤原代细胞和体外培养的B16细胞成瘤率分别为100%和80%，且小鼠右前肢肿瘤(大小约4mm3)出现时间分别约在第3天和第8天。紫杉醇对两种模型的初步评价显示，与体外培养的B16细胞模型相比，原代B16细胞模型是体内筛选和评价特定化合物抗肿瘤活性的一种可行而有效的方法，成瘤时间较短、成瘤率高，所得实验数据误差也较小。小鼠肿瘤模型的建立为相关药物评价模型的开发研究提供了一条可借鉴的新途径。

目前世界范围内癌症最主要、最有效的治疗方法是西医的手术和放化疗。但中医中药在治疗癌症中也同样发挥着重要作用，对可根治的肿瘤，中医可配合手术或放化疗，能减轻治疗的不适反应，增加治疗的耐受性和有效性，提高患者生活质量。对不可治愈的肿瘤，中医中药可以作为一个重要的选择方法发挥抗肿瘤作用。

2、中医治疗黑色素瘤动物模型的研究

（1）影响黑色素瘤肿瘤转移相关基因的表达

对黑色素瘤肺转移B16小鼠的研究中发现益气败毒汤组与环磷酰胺（CTX）组相比疗效尚有差距，与生理盐水组相比小鼠肺转移的肿瘤数明显减少，实验证实CTX及益气败毒汤经胃管给药治疗后，小鼠肺肿瘤组织中肿瘤转移抑制基因nm23的表达强度明显增强，且组间nm23基因强度的表达差异无统计学意义。可见中药制剂益气败毒汤可通过调控肿瘤转移相关基因nm23影响黑色素瘤的转移。

（2）中医通过对免疫系统的影响来改善黑色素瘤

程序性死亡因子1/程序性死亡因子配体（PD－1/PD－Ls）通路的活化可抑制效应T细胞的细胞因子分泌以及增殖活化并促进T细胞的凋亡，进而引发抗肿瘤免疫的失活及肿瘤免疫逃逸。中药黄芪多糖可抑制与免疫细胞活性负相关PD－1/PD－Ls通路以及减少免疫负性调控细胞调节性T细胞（Treg）的数目来抑制黑色素瘤的生长。负性调控细胞Treg可直接抑制T细胞的活化、增殖及相关免疫功能来影响肿瘤生长。在黄芪多糖调节黑色素瘤小鼠PD－1/PD－Ls分子表达的研究中证明黄芪多糖抑制共刺激分子PD－1/PD－Ls的表达，推测这种作用通过增强小鼠T淋巴细胞抗肿瘤免疫活性而抑制肿瘤的生长。

（3）对黑色素瘤血管生产的影响

三氧化二砷（As2O3）及白术内酯I抑制黑色素瘤的主要机制是抑制肿瘤中血管的生成。我国有研究者通过活体成像技术发现经三氧化二砷腹腔注射的小鼠黑色素瘤组织血管密度显著降低，肿瘤组织中心发生坏死，抑制了肿瘤的生长及转移，其抑制肿瘤血管的机制还需进一步研究。还有研究者通过实验证实白术内酯I能够显著抑制血管内皮成管可能与其抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长有关。

（4）抑制黑色素瘤组织内细胞表达

基质金属蛋白酶（MMPs）MMPs是一组Zn2+依赖性肽酶，可以降解多种细胞外基质和基底膜中的胶原成分，从而促进肿瘤侵袭转移及血管生成，其中又以MMP－2和MMP－9研究较多。实验证实人参皂苷Ｒg3能够抑制小鼠黑色素瘤细胞表达MMP－9，使肿瘤的侵袭能力降低抑制黑色素瘤的转移。我国有研究者在木鳖子醇提物抑制小鼠黑素瘤B16细胞体内外侵袭转移的实验研究中证实木鳖子醇提物能下调B16细胞中MMP－2和MMP－9的mＲNA和蛋白水平，但不能降低金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP－1、TIMP－2）的表达。推测木鳖子醇提物抑制黑素瘤B16细胞侵袭的作用机制与其抑制MMP－2和MMP－9的表达有关。

在黑色素瘤动物实验中，除了中药，基因靶向治疗和免疫研究也取得了一些进展，为其应用于临床试验奠定了基础。在黑色素瘤小鼠肿瘤模型的研究上，首先要探索黑色素瘤侵袭转移的分子生物关键机制，并寻找阻断其发展的关键药物；其次，实现黑色素瘤的早发现，早诊断，早治疗，在此基础上探索针对黑色素瘤早期的、敏感的、特异的诊断指标。最后，在药物的联合应用方面也值得深入研究，需要关注药物的联合应用是否进一步提高抗肿瘤效果。