D1蛋白C端兔抗体——PsbA丨D1 protein of PSII

用Agrisera抗PsbA抗体和PsbA蛋白标准对植物和藻类样品中的PsbA进行定量：

方法：植物样品通常在研钵和杵中用液氮研磨。产生的粉末被转移到塑料管中。藻类样品可以通过离心或zui好通过过滤到玻璃纤维过滤器上进行浓缩。在含有0.1mg/mL PefaBloc SC（AEBSF）蛋白酶抑制剂（罗氏）的Agrisera蛋白提取缓冲液（PEB，AS08 300）中进行增溶。通过在液氮中对样品进行快速冷冻，并用微型针尖进行超声处理，以交替解冻，zui理想地获得破坏。根据样品的韧性，可重复此过程。将样品调节至50 mM二硫苏糖醇并加热至70°C 5分钟。在电泳前，对样品进行短暂冷却和离心。

根据目标蛋白质的丰度，使用每个凝胶通道的中等样本量（总蛋白质通常为0.5至2.5 ug）实现zui佳定量。

电泳和免疫印迹：一旦溶解，蛋白质可以在许多系统中进行电泳分离。我们使用使用Bis-Tris 4-12%梯度凝胶的Invitrogen NuPAGE凝胶系统获得zui佳结果。根据制造商的建议，蛋白质在MES SDS运行缓冲液中在200 V下分离35分钟。凝胶在同一装置（SureLock XCell blot module）中转移至PVDF，单个凝胶在30 V电压下转移60分钟，成对凝胶转移80分钟。转移后，用TBS-T中含量不超过10%的无脂奶粉将污渍堵塞1 h/RT，轻轻搅拌。将印迹与一级抗体（通常为1:25 000至1:50 000）一起孵育1 h/RT（如果使用J端femtogram检测试剂），或在较低的一级抗体稀释液中孵育较低灵敏度的试剂（中等皮克和较低）。

对于定量而言，相对较高的一抗：靶蛋白比率比一抗：靶蛋白比率较低的免疫印迹法提供更可靠的结果。

在TBS-T中广泛清洗污渍（两次短暂，一次15分钟，三次5分钟）。将印迹与二级抗体（例如山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶结合物AS09 602（Agrisera））孵育1h/RT。如上所述清洗印迹并使用ECL检测试剂显影。

定量：当定量标准包括在印迹上时，可使用可用软件对样品进行定量。使用Bio-Rad Fluor-S-Max或使用Bio-Rad QuantityOne软件的同等仪器上采集的图像可获得J好的定量。轮廓工具用于选择定量区域，并减去背景值，得出每个标准品和样品的调整体积（单位：计数）。使用上述协议，在目标负载的1-1.5个数量级范围内生成线性标准曲线。需要注意的是，免疫检测通常显示强S形信号-负载响应曲线，低负载跟踪检测区域、伪线性范围和高负载饱和响应区域。对于免疫定量而言，样本中的目标蛋白和标准曲线在伪线性范围内是至关重要的。我们使用该协议的总检测范围超过2个数量级，但可量化范围更窄。

艾美捷 PsbA|D1 protein of PSII应用实例：

在4-12%NuPage（Invitrogen）LDS-PAGE上分离（1-4和6-8）原绿球菌的2µg总蛋白，用蛋白提取缓冲液PEB（AS08 300），（9-12）PsbA蛋白标准品（AS01 016S），（5）分子量标记（魔术标记，Invitrogen）提取，并在PVDF上印迹1h。在吐温-20（TBS-T）中加入2%的封闭试剂搅拌1h/RT后，立即封闭印迹。将印迹以1:50000的稀释度在一级抗体中搅拌培养1h/RT。倾析抗体溶液，将印迹短暂冲洗两次，然后在室温下搅拌，在TBS-T中洗涤一次15分钟，洗涤3次5分钟。在二级抗体（抗兔IgG-辣根过氧化物酶结合物）中培养印迹，稀释至1:10000 in，搅拌1h/RT。按照上述方法清洗印迹，并根据制造商说明使用ECL检测试剂显影5分钟。使用CCD成像仪（FluorSMax，Bio-Rad）和Quantity One软件（Bio-Rad）获得斑点图像。在原绿球菌样品中，PsbA的各种较小的C-末端裂解产物很明显；这些都是真实的，并且根据治疗和生长条件的不同，它们的变化方式也不尽相同。

Agrisera公司提供的植物领域的抗体涵盖拟南芥、莱茵衣藻、蓝藻、松柏类、硅藻、大豆、大麦、蒺藜苜蓿等等。艾美捷科技是Agrisera的中国代理商，为科研工作者提供优质的PsbA|D1 protein of PSII。