生化实验讲义(理论部分)一－－绪论（二）

上一篇 / 下一篇 2008-09-26 12:13:39/ 个人分类：生化检验

⑶ 微量进样器

微量进样器常用作气相和液相色谱仪的进样器，在生化实验中主要是用作电泳实验的加样器，通常可分为无存液和有存液两种。

1) 0.5L ～5L无存液微量进样器：进样器的不锈钢芯子直接通到针尖端处，不会出现存液，所以可用于5?L以下的极微量液体进样。

2) 10L～100L有存液微量进样器：不锈钢的针尖管部分是空管，进样器的柱塞不能到达，因而管内会存有空气或液体，其使用注意事项是：① 不可吸取浓碱溶液，以免腐蚀玻璃和不锈钢零件。 ② 因为有存液，所以吸液时要来回多拉几次，将针尖管内的气泡全部排尽。 ③ 针尖管内孔极小，使用后，尤其是吸取过蛋白质溶液后，必须立即清洗针尖管，防止堵塞。若遇针尖管堵塞，不可用火烧，只能用φ0.1mm的不锈钢丝耐心串通。 ④ 进样器未润湿时不可来回干拉芯子，以免磨损而漏气。 ⑤ 若进样器内发黑，有不锈钢氧化物，可用芯子蘸少量肥皂水，来回拉几次即可除之。

⑷ 自动取液器

这种取液器在生化实验中大量地使用，它们主要用于多次重复的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液的准确度(即容量误差)为 ±(0.5%～1.5%)，移液的精密度(即重复性误差)更小些，为 ≤0.5%。

取液器可分为二种：一种是固定容量的，常用的有100?l 、200?L和1000?L等几种;另一种是可调容量的取液器，常用的有200?L、1000?L和5000?L等多种规格。每种取液器都有其专用的聚丙烯塑料吸头，吸头通常是一次性使用，当然也可以超声清洗后重复使用，而且此种吸头还可以进行120℃高压灭菌。

可调式自动取液器的操作方法是用拇指和食指旋转取液器上部的旋钮，使数字窗口出现所需容量体积的数字，在取液器下端插上一个塑料吸头，并旋紧以保证气密，然后四指并拢握住取液器上部，用拇指按住柱塞杆顶端的按钮，向下按到第一停点，将取液器的吸头插入待取的溶液中，缓慢松开按钮，吸上液体，并停留1～2秒钟(粘性大的溶液可加长停留时间)，将吸头沿器壁滑出容器，用吸水纸擦去吸头表面可能附着的液体，排液时吸头接触倾斜的器壁，先将按钮按到第一停点，停留一秒钟(粘性大的液体要加长停留时间)，再按压到第二停点，吹出吸头尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下吸头，可按下除吸头推杆，将吸头推入废物缸。

自动取液器的使用注意事项是： ① 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 ② 为获得较高的精度，吸头需予先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。③ 浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。④ 可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g。

1.6 缓冲溶液与pH测定

缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂(即纯水)所得的溶液，溶液内所溶解的溶质(化合物)称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。

缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值：

表1—3 人体体液pH

体液 pH 体液 pH

血清 7.35～7.45 大肠液 8.3～8.4

成人胃液 0.9～1.5 泪 6.6～6.9

唾液 6.3～7.1 尿 4.8～7.5

胰液 7.5～8.0 脑脊液 7.35～7.45

1.6.1 基本概念

⑴又称酸碱质子理论。1923年由丹麦化学家J.N.Brönsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，发展了酸碱理论，被后人称为酸碱质子理论或Brönsted-Lowry酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离子(如：H2O，HCl，NH4+，HSO4— 等)称为酸，凡能接受质子的分子或离子(如：H2O，NH3，Cl—等)称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。

⑵ 缓冲体系的设计：

强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子，弱电解质溶于水时，则不完全解离，只有部分的分子解离出正负离子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸(HA)及其盐溶于水时，只有部分HA解离为 H+ 和 A—离子

1.6.2 生物化学常用缓冲液

⑴ 磷酸盐缓冲液

磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：

NaH2PO4： pKa1=2.12， pKa2=7.21

Na2HPO4： pKa1=7.21， pKa2=12.32

配酸性缓冲液：用 NaH2PO4，pH=1～4，

配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH=6～8，

配碱性缓冲液：用 Na2HPO4，pH=10～12。

用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS(十二烷基硫酸钠)会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。

磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液;②适用的pH范围宽;③pH受温度的影响小;④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。

其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀;②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。

⑵Tris(三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane)缓冲液

Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。

Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如：

Tris-HCl缓冲液： pH=7.5～8.5

Tris-磷酸盐缓冲液： pH=5.0～9.0

配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法;②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。

Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液;②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。

其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1;②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，例如：4℃时缓冲液的pH=8.4，则37℃时的pH=7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。

⑶ 有机酸缓冲液

这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH=3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。

甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值：pKa1=3.10，

pKa2=4.75， pKa3=6.40。琥珀酸有二个pKa值：pKa1=4.18， pKa2=5.60。

有机酸缓冲液的缺点是：①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用;②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子(Fe3+、Zn++、Mg++等)结合而使缓冲液受到干扰;③这类缓冲液易与Ca++离子结合，所以样品中有Ca++离子时，不能用这类缓冲液。

⑷ 硼酸盐缓冲液

常用的有效pH范围是：pH=8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。

⑸ 氨基酸缓冲液

此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：

甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0，

甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，

甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，(此缓冲液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液)，

组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5，

甘氨酰胺(glycine amide)缓冲液：pH=7.8～8.8，

甘氨酰甘氨酸(glycylglycine)缓冲液：pH=8.0～9.0。

此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。②试剂的价格较高。

⑹ 两性离子缓冲液(Zwitterionic buffers)，又称Good’s缓冲液

1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Good’s缓冲液可查阅有关的资料。

Good’s缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。

1.6.3 pH值的测定

测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。广泛pH试纸的变色范围是pH=1～14、9～14等，只能粗略确定溶液的pH值。另一种是精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是2～3个pH单位，例如有pH=1.4～3.0、0.5～5.0、5.4～7.0、7.6～8.5、8.0～10.0、9.5～13.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸(不可用手拿，以免污染试纸)，用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测。试纸要存放在有盖的容器中，以免受到实验室内各种气体的污染。

精确测定溶液pH值要使用pH计，其精确度可达0.005pH单位，关键是要正确选用和校对pH电极。过去是使用两个电极，即玻璃电极和参比电极(甘汞或银—氯化银电极)，现在它们已淘汰，被两种电极合一的复合电极所代替。

玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感，其头部为一薄玻璃泡，内装有0.1N HCl，上部由银～氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时，薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的pH，即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度(活度)的变化而变化。

参比电极的功能是提供一个恒定的电位，作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极(Hg/HgCl)或银—氯化银电极(Ag/AgCl)。参比电极电位是氯离子浓度的函数，因而电极内充以4M KCl或饱和KCl，以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和KCl是为使电极内沉积有部分KCl结晶，以使KCl的饱和浓度不受温度和湿度的影响。

现在pH测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极，即将它们共同组装在一根玻璃管或塑料管内，下端玻璃泡处有保护罩，使用十分方便，尤其是便于测定少量液体的pH值。

使用时应注意：

⑴经常检查电极内的4mol/L KCl溶液的液面，如液面过低则应补充4mol/L KCl溶液。

⑵玻璃泡极易破碎，使用时必须极为小心。

⑶复合电极长期不用，可浸泡在2mol/L KCl溶液中，平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液中，使用时取出，用洗并冲洗玻璃泡部分，然后用吸水纸吸干余水，将电极浸入待测溶液中，稍加搅拌，读数时电极应静止不动，以免数字跳动不稳定。

⑷使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。

⑸使用前要用标准缓冲液校正电极，其数据见书后附录，常用的三种标准缓冲液是pH=4.00、6.88和9.23(20℃)，精度为±0.002pH单位。校正时先将电极放入6.88的标准缓冲液中，用pH计上的“标准”旋钮校正pH读数，然后取出电极洗净，再放入4.00或9.23的标准缓冲液中，用“斜率”旋钮校正pH读数，如此反复多次，直至二点校正正确，再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。

⑹电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的pH值时，玻璃泡表面会覆盖一层蛋白质膜，不易洗净而干扰测定，此时可用0.1mol/L HCl 的1mg/mL胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若电极保存时间过长，校正数值不准时，可将电极放入2mol/L KCl 溶液中，40℃加热一小时以上，进行电极活化。

pH测定时会有几方面的误差：

⑴钠离子的干扰：多数复合电极对 Na+ 和H+ 都非常敏感，尤其是高pH值的碱性溶液，Na+ 的干扰更加明显。例如，当Na+ 浓度为0.1mol/L时，可使pH值偏低0.4～0.5单位。为减少Na+ 对pH测定的干扰，每个复合电极都应附有一条校正Na+干扰的标准曲线，有的新式的复合电极具有Na+ 不透过性能，如无以上两个条件，则可以将电极内的KCl换成NaCl。

⑵浓度效应：溶液的pH值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关，因为溶液pH值取决于溶液中的离子活度而不是浓度，只有在很稀的溶液中，离子的活度才与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高十倍的“贮液”，使用时再稀释到所需浓度，由于浓度变化很大，溶液pH会有变化，因而稀释后仍需对其pH进行调整。

⑶温度效应：有的缓冲液的pH值受温度影响很大，如“Tris”缓冲液，因而配制和使用都要在同一温度下进行。

1.7 生化实验室的基本设施与装备

1.7.1 温度与环境设施

许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进行操作，因此，一个正规的生化实验室必须能够保持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件，实验室都应装备空调和加湿器等，而仪器分析室则要求保持干燥，一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥箱中。由于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在不同的温度下保存，实验室必须备有4℃、-20℃、-80℃的冰箱，需要在更低温度下保存的样品，则须使用液氮罐。对于需在较高温度下进行的操作，则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备有干冰，以便使用乙醇～干冰浴进行样品的快速冷冻分装。

1.7.2 实验室用纯水

生化实验室使用最多的溶剂是“水”，配制生化实验用试剂不能用自来水，只能使用经过纯化的水。生化实验对所用水的纯度是要求比较高的，通常可以认为，水的质量越高，实验的结果就越真实可靠和准确，为此必须保证实验用水的质量。常用的两种纯水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊的生化实验中要求更高的水质，如15～18 MΩ-cm高纯无离子水、无热源高纯水、无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。

实验室制备无离子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂和聚苯乙烯季胺型强碱性阴离子交换树脂填充的阳离子和阴离子交换柱，或是阴、阳离子交换树脂的比例为2∶1的混合柱。无离子水的水质用电阻率表示，最高纯度是18 MΩ-cm(25℃)。虽然无离子水中阴、阳离子的含量可以很低，但用离子交换法却不能去除水中的有机物杂质，离子交换树脂中的低分子有机化合物亦可能溶于水，因此由无离子水的电阻率不能看出水中有机物的污染程度，有机物的污染有可能干扰生化实验中的某些反应，也会使水的紫外吸收增加，对于那些对紫外吸收要求十分严格的实验，应选用蒸馏水而不用无离子水。

实验室中制备蒸馏水，多采用石英管加热的硬质玻璃蒸馏水器，蒸馏时不能用自来水，因为会产生水垢，最好用无离子水作为水源。如欲除去有机物，可在蒸馏水器中每升水加1g高锰酸钾和1mL 85%的磷酸，以便通过氧化除去有机物。不含金属离子的水，需用亚沸蒸馏水，即用石英亚沸蒸馏器进行蒸馏，其特点是在液面上方加热，但水并不沸腾，只是液面处于亚沸状态，可将水蒸气带出的杂质减至最低，但制水量较小，每小时约1～4升。

实验工作中不应盲目追求水的纯度，水的价格随水质的提高而成倍地增长，因此要根据实际工作的需要，即所用水中应排除的干扰物质的类型，来选用水的种类，如：无离子水、普通蒸馏水、二次蒸馏水、亚沸蒸馏水及按特殊要求制备的高纯水等。

所有的各种纯水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产生有紫外吸收的有机物;玻璃和金属容器会产生金属离子的污染;长时间放置更会使水长菌，空气中的二氧化碳会溶入水中，所以贮存高纯水一定要隔绝空气，密封盖严，必要时贮存在冰箱的冷藏室中。

1.7.3 消毒系统

生化实验要进行生物培养和生物反应的操作，这些操作都必须排除其他生物因素的干扰，因此在做这些实验之前，都必须对实验中用到的、可能造成污染的材料、器械等进行消毒灭菌处理。常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。

1.7.4 计量系统

生化实验都要求在各种标准的定量条件下进行，因此实验室必须配备各种标准的定量系统。常用的定量系统有：称量系统、液体体积度量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。

⑴ 称量系统：最常用的设备是各种千分之一的扭力天平、电子天平和各种万分之一的单、双盘天平和电子天平等，它们分别用于各种缓冲液的配制和标准物质的称量等。

⑵ 液体体积度量系统：常用的有各种量筒、移液管、容量并、微量进样器和各种自动取液器等。

⑶ 酸碱度pH测量系统：最常用的是pH试纸和pH计。

⑷ 液体溶质定量系统：此系统主要是根据液体溶质的某些理化特性而设计的，不同的物质在一定的条件下有特定的吸收光谱，其吸收值的大小与其在溶液中的浓度有一定的关系，可以通过测定某物质在溶液中的吸收光谱来计算出该物质的浓度，因而分光光度计就是生化实验室必备的仪器分析手段。主要有可见分光光度计、紫外/可见分光光度计和高档的快速扫描紫外/可见分光光度计等。

1.7.5 离心设备

离心方法是分离和制备生物大分子最常用的手段，因而生化实验室必须备有各种形式的离心机。常用的有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。

1.7.6 电泳装置

电泳是生化实验中最常用最重要的实验技术之一，主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电源和电泳槽两部分组成，详见第4章。

1.7.7 层析装置

层析又称为色谱，是分离各种生物大分子的主要手段之一，因而各种层析系统和核酸蛋白检测器就是生化实验室最常用的仪器设备。主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等，详见第3章。

1.7.8 光密度仪

激光光密度仪是适用于多种电泳结果分析的仪器。它采用激光为光源，色散性强，线性范围广，分辨率高，所得结果可以在电脑中进行多维的图象处理，并打印出结果，在生化实验室中正得到越来越广泛的使用。

1.7.9 真空印迹系统

该设备是一种利用真空原理将已经分离的生物大分子(蛋白质、核酸)从电泳后的凝胶中转移到膜上的仪器，主要由印迹仪和真空印迹泵组成，印迹效率接近100%，重复性好，方法简易、快速，将转移分子的变性、中和、印迹等所有步骤均在印迹仪中完成，从而避免了凝胶受损。

1.7.10 核酸自动合成仪与测序仪

用于DNA、RNA的自动合成及序列测定。