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了珩 留言于2016-10-16 13:56:14
- 您好，我的蛋白是包涵体的，老大的意思是直接用超声后的沉淀加buffer跑page，然后切胶加佐剂免疫白兔，制备多克隆抗体。那么问题是：
1. buffer中能够含有sds和β巯基乙醇吗？
2. 蛋白样本加buffer后可以高温变性吗？
求您解答，我到处都查不到，老大还催我，记得要哭了。。。。
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charliechao 留言于2015-08-25 17:05:08
- 您好，
最近关注到您在分析测试网上的帖子，提到转印300K分子量的蛋白，我想请教下，您用湿转的电压和时间分别是多少呢，非常感谢！
附：
大分子量WB主要难度在电泳上，孵抗体什么的和小分子量的没什么区别
1 我来介绍一下我的经验，我做过400kd的蛋白，试过很多种方法，包括梯度胶等等，捣鼓了很久，最后发现一个简单的改变就可以轻松实现。
1.将单叉和双叉的比例由1：29改为1：60，这将极大的增加胶联的孔径。
2.分离胶用6%，浓缩胶4%，在剥胶的时候会发现胶非常的稀软，像鼻涕一样，但它毕竟是成型的，有一点耐心，小心的把它从板子上剥下来。
3.电泳时间：选择分子量最大的预染MARKER，我用的是250kd，然后在电泳槽周围堆满冰，120ma使劲跑吧，跑两个小时换一次电泳液，一直跑到250kd的MARKER，离开胶释放到电泳液中，大概要用5个小时。这时候400kd的蛋白在离开浓缩胶边界0.5~1cm的地方。
4.转膜：虽然湿转更好，但当时实验室只有半干转膜仪，于是加大电压1h，就OK了，时间再长就太热了。
5.孵育抗体什么的都是一样的，但是建议蛋白上样量大一点，毕竟转膜不会转的很干净，会有损失的，而且大分子量的带一般不会很平齐，因为分子量大很多是由于糖基化修饰的缘故，每个蛋白不能保证都修饰的一模一样。
这么做效果还是很好的，相关的文章已经在5分多的杂志发表了，希望可以解决的你的问题
