CryoARM 冷冻电镜:清晰“看见”氢原子、电荷与化学键

蛋白质中的氢原子、电荷分布和化学键极性对结构稳定性发挥着至关重要的作用，并对一系列蛋白质功能和特性有重要影响。例如，酶的催化反应、能量传递以及底物药物结合等。然而，氢原子在蛋白质复杂结构中的精确位置却一直难以确定。主要原因是氢原子与电子或X射线的相互作用信号太弱，使常规手段难以捕捉足够强的氢原子信号。

近日，日本理化学研究所(Riken)相关研究人员利用JEOL CryoARM300冷冻电镜，获取了分辨率为1.19Å的铁蛋白密度图，并实现了蛋白质结构中七成氢原子的可视化。研究人员基于该高分辨蛋白结构，可以进一步研究蛋白质中的负电荷分布和化学键性质等关键结构信息。这一研究结果有望揭示蛋白质的详细化学特性与功能作用机制。这将为生命科学、医学研究与新药开发做出重大贡献。上述研究结果发表在Communications Chemistry期刊上。

研究人员使用JEOL CryoARM300冷冻电镜获取了7900张铁蛋白图像，并从中提取了200万个蛋白颗粒进行三维重构，最终绘制出1.19Å的超高分辨密度图。基于这些高分辨信息，研究人员可以清晰观察到蛋白质中每个原子的密度。为了获取氢原子信息，研究人员采用差值算法策略。基于特定权重算法，研究人员将上述密度图减去铁蛋白分子结构模型(无氢原子)，获取差值图。这种差值算法是检测蛋白中的弱信号(如基质、药物分子以及氢原子)的有效手段。如果使用不含氢原子的铁蛋白分子模型，其差值图中出现的正值可以认为是源自实验数据中的氢原子密度信息。

研究人员在差值图中观察到铁蛋白中约70%的氢原子，尤其是蛋白质中刚性较强的核心部位的氢原子。例如，在酪氨酸中，所有的氢原子均被识别（图1a）。并且，研究人员发现其苯环顶端的羟基氢原子向邻近侧链的氧原子弯曲，形成氢键。此外，在与酪氨酸相邻的一个水分子中，两个氢原子也清晰可见（图1a，红色箭头）。

氢原子的另一重要作用是更精确地区分氨基酸种类。某些氨基酸具有相近结构，仅根据冷冻电镜密度图难以区分。然而，它们的化学性质不同，对蛋白质功能和结构形成有显著影响。天冬酰胺和天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酸胺是典型例子。二者的区别在于侧链末端是否含酰胺基团。如果密度图缺乏氢原子信号，难以判断是哪一类氨基酸。 然而，如果密度图能够清晰地显示氢原子，则可以观察到中性条件下，天冬氨酸和谷氨酸的羧基无氢原子(图1c,e)，而天冬酰胺和谷氨酰胺的氨基上有两个氢原子(图1b,d)。从而可以明显区分这些相似的氨基酸。

图1:酪氨酸(a);天冬酰胺(b);天冬氨酸(c);谷氨酰胺(d);谷氨酸(e)侧链密度图和分子式。绿色密度为氢原子密度信息。

通过对高分辨密度图的进一步分析,研究人员发现其中蕴含蛋白质中负电荷分布的信息。电子的散射是由原子周围的库伦电势导致的,因此,中性原子和带电原子的原子散射系数在低分辨率区域存在明显差异。基于前人报道的三维电子衍射结果,可以知道负电荷会降低电子的散射系数,从而导致密度信息的缺失。因此,差值图中会出现负值信号。

研究人员通过去除密度图中高分辨率成分(分辨率3.0-1.19Å或2.5-1.19Å)，仅使用低分辨率成分(分辨率100-3.0Å)进行差值图计算，发现天冬氨酸和谷氨酸侧链的氧原子位置出现负值信号（图2红色网格）。为了验证这一信号来自于负电荷，而非电子辐照损伤，研究人员去除了密度图中的低分辨率信号,只留下分辨率为2.5-1.19Å的密度信息进行差值图计算。此时，负值信号几乎消失。这说明氧原子高分辨密度信息与其他原子一致,这一发现与中性原子和带电原子在高分辨率区散射系数近乎相等的事实相符(图3)。由此可知,低分辨差值图中的负值信号源自负电荷，而非辐射损伤。

图2:如果只用Movie前两帧的低分辨密度信息(100-3.0Å)来计算差值图，就会出现负值信号，用红色网格表示。如果只用所有帧的高分辨率密度信息(2.5-1.19Å)部分来计算差异图，则负值信号消失(蓝色网格为原始密度信息)。

图3: 在低分辨率区域中,来自中性氧原子(O)和氧离子(O-)的电子散射系数差异很大。

最后,研究人员发现,由于不同类型化学键的极性不同,氢原子和成键伙伴原子之间的距离也不同。对于与高极性氨基中氮原子结合的氢原子和与碳原子结合的氢原子来说,可以发现它们与各自的成键伙伴原子的距离表现出显著差异。这表明,结果数据中包含的信息可以用于识别氢原子的化学结合状态和极性。

以上结果展示了JEOL冷冻电镜的新可能性:有望能发展成为分析化学键性质和电荷的有力工具。通过这些分析技术,可以更深入地了解生物大分子的功能和特性,有助于生命科学、药物发现和医学的发展。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s42004-023-00900-x