抗体发现是开发单克隆抗体药物、双特异抗体药物、ADC 药物和Car-T细胞治疗药物的必经之路。目前，单克隆抗体发现的技术主要有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单B细胞筛选技术。其中单B细胞筛选技术由于其研发周期短而备受瞩目。
该技术将单细胞分离鉴定与分子生物学结合，获得单个B细胞抗体基因并进行体外克隆和表达，获得的抗体保证了轻重链可变区的天然配对；相较于传统的抗体制备技术，具有效率高、全人源、基因多样性丰富、细胞数量少、周期短、适用于任意动物抗体筛选等优点。但是，由于抗原特异性细胞的比例较低，需要借助高通量及高灵敏的分选系统对少量的特异性 B 细胞进行富集。
近期，Amgen提出了一种使用CellCellector 全自动无损细胞分离系统从用重组治疗蛋白EGFR 免疫的Xeno Mouse R（XM）中分离单个抗原特异性原代B细胞的方法。这种方法为抗原特异性抗体的分离和验证提供了一个快速、高效和经济的平台。
整篇研究，思路清晰，流程简单，解析如下：
1
使用CellCelector Flex全自动无损细胞分离系统分离EGFR特异性B细胞
从三只接种EGFR-ECD（EGFR的ECD结构域）的小鼠身上获得了200 万个CD138 阳性的抗体分泌细胞（antibody-secreting cells，ASCs），这些小鼠显示出EGFR滴度。CD138（Syndecan-1）的表达已被用于广义地定义ASC 群体。
1
我们将60,000个细胞加载到包含约60,000个纳米孔/孔的六孔板（CellCelector特色耗材）中，以实现平均每个纳米孔一个细胞。
2
将抗人IgG Fc 特异性beads、抗人IgG连接的Alexa Fluor647（AF647）、生物素化的EGFR和AlexaFluor488（AF488）连接的链霉亲和素的混合物与细胞进行孵育。
3
通过CellCelector的明场和荧光通道成像功能扫描了52,000个纳米孔，以确定含有分泌抗体（AF647+）和与EGFR结合阳性（AF488+）的B细胞。
4
最终确定了1,189个含有ASCs（IgG-AF647阳性）的纳米孔和238个含有EGFR特异性ASCs（AF488和AF647双阳性）的纳米孔，利用CellCelector导出94个EGFR阳性的ASCs用于IgG重链和轻链的分子回收（图1）。
图1. 双阳性细胞的代表性荧光和明场图像。
A) 647nm发射波长的荧光特异性图像（红色）；观察到两个邻孔含有ASCs；(B) 488nm发射波长的荧光特异性图像（绿色），观察到相邻的一个孔含有EGFR特异性的ASC；(C)647和488nm通道的图像叠加；(D)用于挑选EGFR+ASC的明场图像；(E)从纳米孔中挑取EGFR+ASC之前的明场图像和(F) 从纳米孔中挑取EGFR+ASC之后的明场图像。
CellCelector 的优势在于：
用于自动调整毛细管高度的SurePick™ 技术，在挑选过程中对毛细管高度进行动态调整，允许从高度不平或半固体表面进行高效的全自动挑选
用于高通量筛选的Nanowell 纳米孔板技术，每个纳米板含有十万到数百万个纳米孔，实现更高通量的细胞分选
支持全板扫描，每次挑取仅需20-30s，实验操作时间短，自动化程度高
全流程存档记录及质量控制，完全自动化的质量控制过程，包括拣选前后的图像、拣选/失败报告和数据/图像输出
适用于贴壁细胞，悬浮细胞或半固体培养基中的细胞；单细胞，细胞团，球体或菌落；原代细胞或细胞系；活细胞或固定细胞
一机全能，集分选、成像和挑取为一体
2
通过iQue® 高通量流式细胞仪在细胞水平检测抗体结合能力
通过RT-PCR进行IgG重链和轻链扩增并进行了测序，成功克隆、表达和纯化了20个独特的抗体序列。这20个序列被克隆到人IgG1同型的表达载体中，瞬时转染到293T细胞，5天后收获含有抗体的培养基上清，使用Octet® 对上清液进行定量分析，确定其浓度在22至398mg/L之间。使用iQue3® 高通量流式细胞仪测定20种表达抗体与CHO细胞上瞬时表达的EGFR的特异性结合（图2A）
图2. 20个表达的克隆的表征。
(A)通过流式细胞仪测定抗体与表达EGFR的CHO细胞的结合；(B)用BLI测定抗体对可溶性EGFR的亲和力；(C)三个有代表性的亲和力检测结果图显示了与可溶性EGFR的高亲和力（<1nM）、中等亲和力（1-10nM）和无结合。
iQue® 高通量流式的优势在于：
气泡分隔的连续采样技术，使流式细胞术进入高通量筛选(HTS)领域
最小样本体积达到10uL，支持384、1536孔板采样，96孔板只需5min
ForeCyt软件、比起传统流式更简单的使用及维护，硬件配套软件，是高通量流式筛选必备仪器
3
Octet® 非标记分子互作系统从分子水平检测抗体结合能力
通过Octet® 测定抗体对可溶性EGFR的亲和力。AHC传感器固化抗体，然后与EGFR结合解离，EGFR的浓度范围为1.56nM至100nM。结果分为3类：高亲和力（<1nM）、中等亲和力（1–10nM），与可溶性EGFR无结合（图2B和C）。流式结果和Octet®检测结果一致。因此，能够确认来自原代B细胞的分离序列与天然EGFR细胞和可溶性EGFR蛋白有明显结合。
Octet®非标记分子互作系统的优势在于：
非标记Direct binding是趋势，结果更准确
快速测定亲和力，更加定量化地表征分子互作
无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）
写入了美国药典，文章多，认可度广
万金油技术，可以用于检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子；如这篇文章检测的就是病毒颗粒样品
操作简便，耗材及维护成本低
高通量，本文使用RH96，可以同时检测96个样品
本研究通过CellCelector平台快速高效的筛选和分离ASCs，获得阳性B细胞序列后，结合iQue® 高通量流式细胞平台以及Octet® 非标记分子互作系统，3-4周内成功获得抗原特异性抗体，为大家解析了如何利用赛多利斯新三剑客快速高效的进行高单B细胞筛选的典型流程，为新型抗体药物的发展指引了新的方向。
下载文档
下载《基于图像的全自动单细胞及克隆筛选和分离》应用手册，探索抗体发现和生产的有利工具！加速和帮助有效的评估和验证克隆，节约您的宝贵时间。
-参考文献-
[1]CellCelector™asaplatforminisolatingprimaryBcellsforantibodydiscovery. Antibody Therapeutics, 2022, Vol. 5, No. 1 11–17
-END-
