小鼠XX细胞药物干预及核因子蛋白A凝胶电泳迁移率（EMSA）检测

实验分组：
A组 对照组(DMEM 1000ul)                      
B组 A药物组（DMEM 960ul+A药物40ul ）            
C组 A药物+B药物组（DMEM 892.5ul+ A药物40ul+B药物 67.5ul）
D组 B药物组（DMEM 932.5ul+B药物 67.5ul）  
注：培养基与B药物，2小时候加A药物，24小时后收集细胞检测。

实验试剂：LightShift Chemiluminescent EMSA Kit(PIERCE,20148)；Chemilumi-Nucleic Acid Detection Kit（PIERCE,89880）；NF-KB p65探针序列；Boitin-N4-CTP（invitrogen,15918-18）；TdT（NEB,M0252L）；Poly(dI.dC) （sigma,P4929）；Hybond-N+ 尼龙膜（Amersham,RPN303B）；6×Loading Buffer (TAKARA)

实验仪器：离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TG16-W）；电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)；电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170-3930)；

生物素标记探针：
1、按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩
   超纯水                          25μl
   5×TdT Reaction Buffer         10μl
   探针(1μM)                     5μl
   Biotin-N4-CTP                  5μl
   TdT (2U/μl)                   5μl
   37℃反应30分钟
2、加入2.5μl 0.2M EDTA终止反应
3、加入50μl 酚：氯仿，短暂涡漩，15000g离心2min，保留上层水相，-20℃保存。
4、结合反应前等体积混合两条标记引物，90℃退火引物，并自然冷却至4℃，待用。

抽提核蛋白：
1、2-3×10⁶密度铺60mm细胞培养板，培养约12h
2、移去细胞培养基，PBS洗细胞一次
3、加入1mL Buffer B 于培养板，将细胞刮下收集于1.5mL离心管
4、1000g 离心2min，吸去上清
5、加入160μl Buffer A，重悬沉淀，冰育20min
6、加入含2.5％NP-40的Buffer A，涡漩10s，4℃ 15000g 离心5min
7、吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃涡漩25min，4℃ 18000g 离心5min
8、吸取2μl上清采用Bradford法测蛋白质浓度，其余储存于-80℃
   蛋白浓度测定如下表：mg/ml             

配置非变性聚丙烯酰胺凝胶:略

EMSA实验步骤：
1、按如下顺序加入反应物，温和混匀（20μl体系）
   ddw                                 ??
   10×binding buffer                  2μl
   Poly(dI.dC)                         1μl
   核蛋白粗提物                        10μg（温和混匀）
   生物素标记的探针（0.1μM）           0.5μl
室温反应20min，加入6×Loading Buffer 4μl，上样10-20μl，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。
2、电转前将尼龙膜浸泡于0.5×TBE至少10min以预冷的0.5×TBE为电转缓冲液100V转胶于尼龙膜上，45min
3、UV BOX下，以贴近膜一面面向紫外光源，以254nm激发光交联15min
4、加入25mLBlocking Buffer，以约70rpm在脱色摇床上封闭30min
5、将SA-HRP以1:30000-50000稀释于12mL Blocking Buffer，脱色摇床70rpm作用20min(洗膜过程全部在脱色摇床上进行, 约100-140prm)
6、Buffer II  25ml,  5min
7、wash buffer 25ml  15min
8、Buffer III  25ml  5min×2次
9、0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次
10、0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次
11、0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次
12、将膜于滤纸稍适吸干，加入到以1:20稀释的发光反应液，作用1-5min，将尼龙膜封于保鲜膜中（避免褶皱和气泡的产生），暗室曝光1-5min，检测信号。

实验结果：采用Gel Pro 4.0 软件分析（核因子A band）IOD参考数值
p：probe only. 只加入标记探针未加入核蛋白抽提物。
C: Postive Control : 采用德国MERCK公司, Cat#71183-3，Cat#71377-3，Cat#71518-3试剂盒中Hela control Nuclear Extract

实验咨询：service@jiamay.com

嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,***酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。

凝胶电泳迁移率（EMSA）实验服务案例介绍信息由北京嘉美臻元生物技术有限公司为您提供，如您想了解更多关于凝胶电泳迁移率（EMSA）实验服务案例介绍报价、型号、参数等信息，欢迎来电或留言咨询。

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途