多种荧光定量PCR实验

实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异、验证基因芯片和siRNA干扰的实验结果。
英拜为您提供的实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成；主要实验步骤如下：
1. 设计并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR® Green）的PCR反应的优化。
3. 客户样品RNA抽提
4. RNA质量检测
   a． 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。
   b． 使用甲醛电泳试剂（ambion）进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
5. 按照逆转录酶（Invitrogen或Promega）使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中（其中TaqBeadTM 热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTime PCR扩增和检测。
8. 检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 提供实验报告，包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果及相关图表。
lncRNA定量PCR
长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA) 指的是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。它们不编码蛋白，但参与细胞内多种过程调控。近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。lncRNA的种类远远超过编码RNA，哺乳动物基因组序列中4%~9%的序列产生的转录本是lncRNA（相应的蛋白编码RNA的比例是1%-5%）。lncRNA已经成为非编码RNA研究领域的一个热点。
    本公司完善的实验平台和经验丰富的实验人员，可以为您提供完善lncRNA定量PCR技术服务，并完成数据分析，提供完整的实验报告。

a)组织样品（需提供≥100mg组织。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；
b)体外培养细胞（需提供≥10^6个细胞。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；
c)全血 （需提供≥2ml全血）；
d)总RNA （需提供≥5ug total RNA）。
所有类型样品必须用冰袋寄至公司。冰块应足量，以确保样品寄至公司时，冰块未完全融化。

服务报告提交下列数据：实时荧光PCR扩增曲线；熔解曲线；基因表达定量结果分析。
microRNA 实时定量PCR

引物设计、合成
设计并合成目的microRNA的茎环RT引物、PCR引物。

样品RNA抽提
a．组织样品：取适量（50～100mg）新鲜组织或正确保存的组织样品，匀浆后抽提RNA。
b．细胞样品：取1×106～1×107细胞，吸去培养液后用TRIZOL试剂抽提RNA。

RNA质量检测
a．紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
b．用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度和完整性。
注：用于microRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须高纯度、完整，没有RNase 污染（降解的样品不能用于实时定量PCR检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。

逆转录合成cDNA
利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。

实时定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增（同时测定每个样品中U6 snRNA含量作为内参以校正上样误差）。

分析结果、提供实验报告
分析实时定量PCR结果，根据标准曲线定量样品中的目的microRNA。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。

由于cirRNA特殊结构及其表达丰度低的原因，cirRNA定量PCR实验还存在一定困难。本公司经过特殊的引物设计、反转录过程及PCR扩增过程的实验条件优化，能够高效定量检测cirRNA的表达。

CirRNA定量PCR
由于cirRNA特殊结构及其表达丰度低的原因，cirRNA定量PCR实验还存在一定困难。本公司经过特殊的引物设计、反转录过程及PCR扩增过程的实验条件优化，能够高效定量检测cirRNA的表达。
CirRNA定量PCR实验流程如下：
1、样品RNA抽提
2、RNA质检
3、RNA逆转录cDNA
4、cirRNA特殊引物设计及其调试

图3 cirRNA divergent 引物设计
5、cirRNA PCR扩增
6、PCR数据统计
只要您提供样本及待检测的cirRNA名称，本公司可为您完成后续的所有实验。
外泌体microRNA定量PCR 
  外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-100 nm，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。Exosome可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。Exosome在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
    miRNA是一类22nt左右大小的非编码分子， 它可以通过外泌体从一个地方转运到另外一个地方行使基因沉默功能。通过检测外泌体中miRNA表达变化，可以发现外泌体中miRNA特异性功能。

  图1外泌体产生过程的示意图

   图2外泌体miRN PCR扩增曲线            图3外泌体miRN PCR溶解曲线
 
 实验流程：
 

  
 



样品要求
血清样品：2-4ml
外泌体样品：1ml
RNA样品：500ng
单细胞实时定量PCR技服务
    单细胞qRT-PCR是在单细胞水平上对基因的表达进行实时定量分析的技术。常规的qRT-PCR所得结果是数以百万计的细胞的平均水平，只能说明基因在一个细胞群中大致的表达情况。由于细胞的异质性，相同组织的单个细胞实际上可能彼此不同，并扮演不同的角色。单细胞qRT-PCR技术不仅避免了组织水平分析时造成的异质细胞干扰,使得基因表达研究更加精细、准确，而且还能够检测导致细胞分型甚至细胞间惟一差别的表达特征，因而获得了极大关注。
    单细胞qRT-PCR技术为从单核苷酸水平深入研究癌症发生、发展机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路并开辟了新的研究方向。近年来，该方法还被广泛应用于组织器官内细胞基因组的异质性研究、干细胞的异质性研究、以及临床指导的病理研究等各个方面。
 

实验流程：
    由于单个细胞中的mRNA数量很少,大约只有1 pg左右,因而与常规的RT-PCR相比,单细胞RT-PCR在各个环节上都有着显著差异。常规RT-PCR首先要将组织中的mRNA或总RNA抽提出来之后才能进行后续步骤,单细胞RT-PCR显然无法进行抽提步骤,因而在获取单个细胞后,在适当体积的裂解液中将细胞裂解,然后直接以裂解产物为模板进行RT-PCR。由于没有抽提,裂解产物中含有蛋白质、RNA以及基因组DNA等各种成分,蛋白质因其量极其稀少,可以忽略对单细胞RT-PCR的影响,但裂解产物中的基因组DNA相对于mRNA却有可能造成极大的干扰。避免这一影响有两种处理,一是在进行逆转录之前先用DNAaseⅠ消化基因组DNA,另一种方法就是在设计PCR引物时尽量使引物结合序列跨越相邻外显子的结合处。

 

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途