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外泌体转录组测序
外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡,直径约为30-100 nm,具有杯状形态、双层膜结构,天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞(免疫细胞、神经细胞、干细胞),都可以产生并释放exosome。Exosome可通过细胞膜受体直接激活受体细胞,也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA,甚至细胞器进入受体细胞,参与细胞间通讯。Exosome在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
图1外泌体产生过程的示意图
一、实验流程二、数据分析
1. 无参考基因组的转录组分析(De novo Transcriptome Analysis)
数据产出统计及碱基质量评估;
去除低质量、污染及接头序列;
对序列进行de novo组装,并对组装效果进行统计评估;
Unigene长度统计分析及表达丰度分析;
样本间共有、特有及差异Unigene统计;
Unigene功能注释:(Nt、Nr、Swissprot、Interpro、GO、KEGG数据库比对)
Unigene差异表达及聚类分析(不少于两个样品);
差异Unigene的GO和pathway显著性富集分析。
2. 有参考基因组的转录组分析(Transcriptome analysis with reference genome)
数据产出统计及质量评估
Reads与参考基因组序列或转录组序列比对
Reads在基因组上的分布统计
转录本定量
基因功能注释
基因GO 和pathway显著性富集分析
基因表达差异分析(不少于两个样品)及聚类分
基因结构及变异分析:可变剪切、基因融合及cSNP鉴定等
预测新基因
三、案例分析外泌体转录组测序——肺移植后排斥反应的分子机制研究和新生物标志物寻找
Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.Am J RespirCrit Care Med. 2015. IF=13.118
肺移植后急性排斥反应(AR)是移植物功能降低甚至丧失的主要原因,也是导致肺慢性排斥反应(CLAD)的首要危险因素之一。但AR导致CLAD的分子机制尚缺乏了解 。由肺移植细胞分泌的外泌体(exosome)含有多种不同的分子,这些分子可密切反应组织和细胞的生物学状态。 因此外泌体转录组可能有助于我们更好的理解排斥反应过程,而且源于exosome RNA(外泌体中的 RNA 也称外泌体穿梭 RNA,esRNA)的生物标志物可以及时和敏感的检测AR,助于减少严峻AR和CLAD的发生率,提高治疗效果。
为了解肺移植后排斥反应的病理生理学和寻找生物标志物,研究者分别对有AR(n=6)和没有AR(n=6)的肺移植病人进行连续的支气管肺泡灌洗液(BALF)收集,超速离心法分离外泌体后,分别提取外泌体和BALF细胞的总RNA,通过Illumina HiSeq 2500进行测序。并对AR病人外泌体中表达上调的关键基因用同样本进行qPCR和WB验证。
结果发现AR病人和无AR病人的esRNA特征具有明显的差异。基因集分析发现esRNA主要富集在细胞通讯和基础代谢上,且肺基础代谢途径在没有AR症状的病人中高表达于AR病人,而AR病人的上调的esRNA倾向富集于炎症反应通路,包括先天和适应性免疫系统。研究还发现新的上游激活靶标,可用于潜在的治疗干预,且现有的治疗药物可能有效作用于急性排斥反应。另外,对esRNA和细胞RNA进行比较发现,RNA具有很大的差异,尤其是B细胞和T细胞相关产物。
图1. 具有急性排斥反应的样品外泌体中上调基因的通路
三、样品要求血清样品:2-4ml
外泌体样品:1ml
RNA样品:500ng
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