染色质免疫共沉淀PCR实验(chip-PCR)

研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

ChIP实验操作流程：

1、样品准备与交联

细胞收集后，用37%的formaldehyde处理细胞，交联核酸与DNA结合蛋白；

2.超声打断染色质

裂解细胞，用Bioruptor将染色质超声破碎成200－1000bp片断；将片段分为两份，一份用于免疫共沉淀，一份用于对照。

                    图1染色质免疫共沉淀实验流程           图2　超声破碎后DNA电泳图（lane2）

3、免疫共沉淀(IP)

取B步骤所得一份片断与ChIP特异抗体结合进行免疫共沉淀，利用免疫磁珠法富集抗体复合物。

4、解交联及纯化DNA

将富集的DNA/蛋白复合物解交联释放DNA片段，并进行纯化（IP DNA）； B步骤所得用于对照（Input DNA）的片断作不进行IP实验，但也要解交联并纯化。

5、DNA段PCR扩增

针对ChIP DNA, Input DNA及对照DNA的目的片段设计特异性引物并进行荧光定量PCR扩增。

 6、结果分析

%Input=2(CtInput-CtChIP)×Fd×100%

Fold Enrichment = [%(ChIP/Input)] / [%( Negative control/Input)]

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