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实时荧光定量PCR Realtime PCR

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    所谓的实时荧光定量PCR,其反应体系中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。

方法程序
Ø样本处理、RNA提取
ØRNA反转录
ØReal Time-PCR
Ø结果分析

染料法: 
     SYBR Green Ⅰ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green Ⅰ的zei大吸收波长约为497nm,发射波长zei大约为520nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射强荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子仅有微弱荧光信号背景,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。

探针法: 
    PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

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