细胞基因敲除（敲入）全套服务

预实验：

1.       Cas9导入细胞方法：尝试各种方法，如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等，确定高效导入Cas9方法。

2.       药物浓度预实验：降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

3.       单克隆培养情况：观察细胞是否可以单克隆培养。

基因敲除（敲入）：

1.       靶点设计

一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，zei好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个，效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2.       载体构建和病毒包装

根据预实验结果，选择合适的普通载体或病毒载体，吉满生物现拥有3类载体：普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体。

3.       内源活性筛选

转染细胞或感染细胞48H后，使用Puro或Blasticidin筛选48H,提取基因组DNA。使用T7E1酶验证打靶载体的活性。将有效的突变型PCR产物测序验证。

4.       Donor载体(基因敲入)

根据筛选的gRNA靶点位置，构建Donor普通载体或腺病毒载体。共转染/感染 Cas9-gRNA和Donor.

5.       单克隆筛选

无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少2个96孔板。细胞长好够，验证内源活性并送测。

6.       获得突变型

如需纯合子，则可能需要重复步骤3-5。

相关产品链接：

CRISPR/Cas9基因敲除试剂盒

Cas9质粒构建

Cas9腺病毒服务

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途