细胞凋亡实验

摘要： 利用Annexin-V-FITC与PI双染法对和正常细胞、human Oct-4干扰组以及对照组A549细胞的凋亡情况进行检测，研究Oct-4对A549细胞凋亡的影响。实验结果显示Oct-4基因的沉默使A549细胞的凋亡比例增加。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。
关键词：Oct-4干扰，细胞凋亡， A549

一、 实验原理
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自主结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程。
***脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性***脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin V 进行荧光素（FITC、PE）或Biotin 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
***化丙***（propidine iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

二、 实验目的
用Oct-4干扰慢病毒感染A549细胞组与正常细胞组、对照细胞组进行比较分析，使用Annexin-V-FITC/PI双染法考查Oct-4基因对细胞凋亡产生的影响。

三、 实验步骤
实验共分以下4个主要步骤：
1. 转染细胞：
准备细胞，转染前一天按照60-70%密度铺在6孔板中。待细胞贴壁后，按照转染试剂说明书转染细胞（4μg对照/干扰质粒，10μl和元生物转染试剂）。
2. 收集细胞：
转染72h后，将细胞消化后制成单细胞悬液，计数，为满足流式细胞仪上机要求，每个样品准备0.5-1.0×106 cells。
3. Annexin-V-FITC/PI双染进行染色：
1) 1000g离心5min，弃上清。
2) 使用预冷的PBS洗涤细胞沉淀1次，1000g离心5min，弃上清。
3) 实验组加入195μl Annexin-V-FITC结合液重悬细胞（空细胞和空细胞PI单染校正用200μl结合液重悬沉淀）。
4) 加5μl Annexin-V-FITC，用100μl枪轻轻混匀（空细胞和空细胞PI单染校正样品不加）。
5) 室温孵育10min，1000g离心5min，弃上清。
6) 加入190μl Annexin-V-FITC结合液重悬沉淀（空细胞和空细胞PI单染校正组用200μl结合液重悬沉淀）。
7) 加10μl PI，用100μl枪轻轻混匀（空细胞和空细胞单染Annexin-V-FITC校正组不加）。
4. 上机检测：
冰浴避光放置，将细胞移到流式上机管中，上机检测。

四、 实验结果

                                                          图1. Oct-4基因对A549细胞凋亡的影响

  从左开始依次为A549空细胞组，对照组（干扰对照组），实验组（Oct-4干扰组），每组实验均重复3次

                                                图2. Oct-4基因对A549细胞凋亡统计学分析
                                                                   **表示p<0.01

结论：从图1实验结果以及图2的统计分析可以发现，A549细胞在Oct-4基因被干扰后，晚期凋亡比例高于空细胞组以及对照组，且具有统计学意义（p<0.01）。

五、 参考文献
1. Sandström K, Håkansson L, Lukinius A, Venge P.A method to study apoptosis in eosinophils by flow cytometry.J Immunol Methods. 2000 Jun 23;240(1-2):55-68.
2. Chen S, Cheng AC, Wang MS, Peng X.Detection of apoptosis induced by new type gosling viral enteritis virus in vitro through fluorescein annexin V-FITC/PI double labeling.World J Gastroenterol. 2008 Apr 14;14(14):2174-8.
3. Lund PK, Øvstebø R, Møller AS, Olstad OK, Landsverk KS, Hellum M, Kierulf P.Using global gene expression patterns to characterize Annexin V positive and negative human monocytes in culture.Scand J Clin Lab Invest. 2009;69(2):251-64.
4. Arur S, Uche UE, Rezaul K, Fong M, Scranton V, Cowan AE, Mohler W, Han DK.Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment.Dev Cell. 2003 Apr;4(4):587-98.
5. Ashkenazi A, Dixit VM.Death receptors: signaling and modulation.Science. 1998 Aug 28;281(5381):1305-8.

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