转录组测序（RNA-seq）

转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，利用Illumina大规模测定mRNA序列获得转录本信息，该技术具有通量高、覆盖范围广、精度高等特点。其不依赖于基因组参考序列，使所有生物都可以成为研究对象，同时能够在全基因组范围内检测真核细胞中广泛存在的可变剪切现象，为转录本的结构研究、基因转录水平研究、全新转录区域研究等提供重要的研究工具。通过Illumina新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本及基因序列，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

●技术路线：

●分析流程

样品浓度≥200ng/ul，OD260/280为1.8-2.2，总RNA含量≥20ug，干冰运输

1、Fan H, et al. Deep Sequencing-Based Transcriptome Profiling Reveals Comprehensive Insights

 into the Responses ofNicotiana benthamiana to Beet necrotic yellow vein virus Infections 

Containing or Lacking RNA4. PLoS One. 2014; 9(1):e85284.

2、Wang XC, et al. Global transcriptome profiles of Camellia sinensis during cold acclimation. BMC Genomics. 2013; 14:415.

3、Zhai R, et al. Transcriptome analysis of rice root heterosis by RNA-Seq.BMC Genomics. 2013; 14:19.

群体转录组测序

•       DH群体或F2群体测序

1.         构建连锁群

2.         直接定位QTL

3.         eQTL定位

4.         表达验证

•       多品种群体测序

1. GWAS分析

2. 共表达网络

3. 基因变异分析

•       定位群体转录组测序

1.亲本测序深度8G左右

2.比较SNP和Indel信息

群体转录组测序的优势

1.在获得表达数据的同时可以获得序列变异信息

2.序列数据均位于基因编码区段

3.高精度SNP数据足以用于构建遗传图谱

4.可用于无参考基因组或基因巨大重测序成本较高的物种，即便多倍体等复杂基因组也适合

5.便于后续对功能基因的表达分析和调控网络的构建

6.能进行eQTL定位和研究

7.自然群体转录组测序还可进行人工驯化基因的研究

参考文献

1、Harper AL,et al.Associative transcriptomics of traits in the polyploid crop species Brassica napus. Nat Biotechnol. 2012 Aug;30(8):798-802.

全长转录组测序

转录组研究是理解生命过程必不可少的工具之一。然而由于第二代测序平台的诸多限制，其拼接出的转录本通常并不完整，且进行expression analysis时普遍存在偏差性。

目前zei新的PacBio RS II平台的平均读长已达到5-8kb，其长度大大超过一般转录组中典型基因的长度(如1-3kb)，因此，如果将PacBio平台应用于RNA-seq，大部分转录本可以直接测通为全长的转录本。

我们利用第三代测序平台PacBio RS II，可以直接得到从5’端到3’端的高质量全长转录本信息。同时结合第二代测序低价格、海量数据、高准确率读长等优点，从而高性价比地得到基因的全长isoforms序列，同时使得isoforms定量更加可信，大大缩短后续的应用分析时间。

参考文献  

1、Sharon, Donald, et al. "A single-molecule long-read survey of the human transcriptome." Nature biotechnology 31.11 (2013): 1009-1014

单细胞测序

我们采用美国Clontech公司原装试剂盒，能够对真核生物的单个细胞、微量细胞（几个到几千个）和微量Total RNA（10 pg–10 ng）中含PolyA尾的RNA全长进行准确而高效地扩增，扩增后的cDNA片段适用于Illumina建库测序平台，为单细胞样本的RNA-seq分析提供了利器。

参考文献

1、Yan L, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos andembryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 2013, 20(9): 1131-1139.

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