高通量测序－细菌/真菌16S rDNA/ ITS

一、技术简介

16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。16s rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。

在真核生物rDNA 基因中，18S rDNA 和 28S rDNA 基因间隔序列称为（ITS），位于18S和5.8S的为ITS1区，位于5.8S和28S之间的为ITS2区。核糖体DNA中的18S、5. 8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守,在生物种间变化小，而内转录间隔区ITS1 和ITS2作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，可用于对细菌的不同生物型、菌株、种、属进行分类鉴定。甚至用于区分关系非常近的种。

二、技术策略

设计引物扩增16S rDNA/ITS部分可变序列，采用Miseq平台，得到PE 2 ×250部分重叠序列，拼接得到较长序列，通过与特定数据库比对，从而确认某物种的存在与否，继而进行生物信息分析。

三、技术路线

四、分析结果

1. 测序序列统计（质控结果统计）

2. 物种信息分类统计, alpha/beta diversity analyses

3. OTU (Operational Taxonomic Units)分析及其进化树

4. 序列注释

5. Unifrac clustering analysis；

五、案例解析

案例一

Scher J.U, et al. Expansion of intestinal Prevotella copr icorrelates with enhanced  susceptibility to arthritis. eLife，2：01202. （2012）

文章中用16S技术，对114份关节炎病人和健康人的粪便进行分析，并用进一步对另外44份样品进行分析，找到了普氏菌与关节炎前期之间的关系。

1. 实验设计

提取114份健康人和关节炎病人的粪便，采用16S技术，分析样品中的细菌丰度，从而找出与关节炎相关细菌的菌种——普氏菌。采用meta分析方法，进一步验证普氏菌的病原性作用。

2. 实验结果

图1. 健康人（HLT）和第一次得风湿性关节炎病人(NORA) 16S分析得到的不同的OTU及其大小

图2. 通过样品中菌种的丰度，能够计算样品间Bray-Curtis距离，从而可用PCA进行分离。（红色对应的是普氏菌丰度较高的样品，蓝色对应的是多形杆状菌丰度较高的样品）

图3. 不同人群中，样品中普氏菌（红色）和多形杆状菌（蓝色）之间的对立关系

案例二

Caporaso J.G, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth ofmillions of sequences per sample. PNAS, vol. 108: 4516-4522. (2011)

文章对IlluminaGAIIx测序平台用于16S分析的可行性进行分析。结果显示采用Illumina GAIIx 测序平台测序进行的16S分析，在样品菌群结构和复杂性分析等方面能够达到宏基因组分析一样的效果。

1. 实验设计

提取25个环境样品和3个已知的“mock communities”， 16S分析样品中菌群结构和物种复杂程度，得到的结果与已发表的一些meta分析文章结果进行对比，对比这两种方法在分析样品菌群结构和复杂程度的差异与否。

2. 实验结果

图1. 采用Illumina测序平台，同样能够重复出样品中微生物在目和属水平的分布，即丰度组成

图2. 通过聚类，能将同一来源的样品很好的归为一类

六、技术优势

1. 强大的实验测序平台，测序周期短且可靠；

2. 成熟的分析方法，专业的技术人员；

七、参考文献

1. Perez-Cobas A.E. Differential Effects of Antibiotic Therapy on the Structure and Function of Human Gut Microbiota. PLOS ONE, Vol 8, issue 11. (2011) 

2. Catherine A. L. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota.  Nature, vol 489. (2012)

3. Taylor J.D. Seasonal microbial community dynamics correlate with phytoplankton-derived polysaccharides in surface coastal waters. ISME 8, 245-248. (2014)

八、常见问题解答

1. 16S分析样品要求

答：对于DNA样品， OD260/280在1.8～2.0之间，浓度大于30ng/µl，总量大于5µg，样品质检无降解痕迹。

2. 样品测序产出量

答：16S样品测序后，按照分析要求每个样品将产出几万到几百万的reads数。

3. 从收到样品到完成测序分析周期

答：收到样品后，从建库到高通量测序，一般控制在20个工作日完成。生物信息学基本分析，根据样品数的多少，一般在20个工作日完成。

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