环状DNA测序（ecc DNA测序）

染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNAs，eccDNAs)是指位于染色体外的，呈单链或双链的闭合环形DNA结构。相比于游离的线性DNA，eccDNA不易被核酸酶降解，结构上更加稳定。EccDNA广泛存在于包括人类的各种真核生物中，具有很高的组织和疾病特异性。

传统观点认为真核基因组通常形成稳定的线性染色体。但最新的研究表明：无论是在正常体细胞还是癌细胞中，都存在大量染色体外环状DNA。近日，Nature杂志上发表了颠覆性研究成果：在肿瘤中，主要的癌基因转录本是直接来自于eccDNA的，而eccDNA的染色质是高度开放的，eccDNA的癌基因能够大量表达，同时缺乏丝粒，导致不遵照孟德尔定律进行遗传，这种特性使得eccDNA是驱动肿瘤异质性的重要机制。由此可见，由于其结构和表达的特异性，eccDNA可以影响细胞生命活动，促进肿瘤细胞演进和适应性进化，增加了基因组的可塑性和不稳定性。目前，eccDNA不仅仅可以作为一种新型特异的肿瘤标志物，还在肿瘤发生发展机理研究中发挥着重大的潜在价值。可以预见的是，eccDNA将迅速成为新的科研热点，甚至会对传统遗传学和基因组学带来革命性影响。

环状DNA形成机理

目前研究表明，环状DNA是从染色体上断裂、环化或者额外复制产生的序列，其剪切加工机理主要提出有两种可能：（1）通过染色体异位同源重组环化（intrachromatid ectopic homologous recombination，HR）;（2）通过非同源染色体末端连接环化（nonhomologous end-joining，NHEJ）。EccDNA形成是一个复杂的过程，更多环化方式有待探索。

eccDNA 形成模型示意图

环状DNA测序服务

云序生物环状DNA测序服务（eccDNA-seq），采用多种方法高效地富集和扩增环状DNA，极大地提高了环状DNA的检出率。富集后，通过NGS测序高通量地检测细胞中所有的环状DNA分子。并通过严谨的环状DNA生信流程，实现了对环状DNA准确的识别和详细的基因注释。

别名：Circle-Seq，CircDNA-Seq

云序生物eccDNA测序流程示意图

云序优势

国内率先提供该服务的测序公司：

通过长期的摸索，率先开发出成熟的测序流程，成为国内目前率先提供该服务的测序公司。

富集效率高：
染色体外环状DNA的富集效率是决定数据质量的关键，云序生物精心优化和研发的实验流程，具有极高的富集效率和特异性。

识别率高：
专业的生物信息学团队，通过优化的算法能够高效识别染色体外环状DNA。

一站式服务：

客户只需提供细胞、组织或基因组DNA，云序生物为您完成从样品准备、环状DNA富集、文库制备、上机测序到数据分析的整套服务流程。

样本要求

样品类型：

细胞、组织、基因组DNA。其它类型样品请详询。

样品量：

a）细胞 5×108

b）组织 200mg

c）DNA：每个样品总量不少于10ug，溶于无菌水或 TE（PH = 8）（OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染）。

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL Eppendorf管中，封口膜封好，干冰运输，DNA可用冰袋运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块切块，液氮冻存后-80℃保存；DNA样品短期内可-20℃，避免反复冻融。

 案例解析 

案例1：环状DNA促进染色质的开放和促癌基因的表达

原文：Wu, S., Turner, K.M., Nguyen, N. et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) .

期刊：Nature 影响因子：43.07

研究团队首先结合二代全基因组测序和光学匹配（optical mapping），从序列的角度发现，扩增出来的eccDNA形成了环状结构,不仅证实了肿瘤中的eccDNA确实是环状的，还证明了eccDNA的染色质是高度开放的，从而进一步阐释了eccDNA能大量表达癌基因和其环状结构介导的超远距离相互作用，这也表明了eccDNA可能形成了新的基因调控回路和在驱动肿瘤异质性的机制研究中发挥着重大的作用。

图1. eccDNA环状结构介导超远距离相互作用

案例2：癌基因与邻近增强子的环化共扩增

原文：Morton AR, D ogan-Artun N, Faber ZJ, et al. Functional enhancers shape extrachromosomal oncogene amplifications. Cell. 2019 Nov 27;179(6):1330-1341

期刊：Cell 影响因子：36.22

本文作者利用染色体外环状DNA测序探讨了癌基因及其邻近增强子通过环状染色体外DNA的形式进行扩增事件，研究过程中发现了EGFR基因在成胶质细胞瘤中存在与其上游约130kb的非编码序列共同扩增的特征，EGFR基因案例表明肿瘤细胞中的癌基因通过高级扩增与环化而形成的对自身调控活性的增强，是一个十分有效的促癌机制。总之，这项研究综合利用各项计算分析和实验手段，首次揭示了增强子在癌基因环化扩增介导的促癌效应中所发挥的重要作用，这一机制也为抗肿瘤和诊断提供新的方向和理论依据。

图2. EGFR与邻近增强子共扩增事件存在于染色体外环状DNA上

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