真核转录组测序

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带。真核生物转录组测序基于高通量测序可快速地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的所有转录本的集合，用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控、逆境胁迫和抗病反应机制的研究手段。

欧易特色

具备处理复杂样本的能力

丰富的建库经验，加入文库均一化技术

协助客户快速、准确性地进行生物信息分析

可结合客户的需求灵活进行定制化信息分析

A.真核生物转录组测序（有参考基因组物种）

推荐测序模式

HiSeq4000, PE150 

6Gb/每个样本

案例展示

案例一  肝损伤程度决定肝细胞命

研究背景

目前仍缺乏治疗肝细胞癌的有效手段，已证实细胞衰老在抑制癌病变中起重要作用，因此，作者认为细胞衰老可能成为治疗肝细胞癌的潜在靶点。

研究内容

欧易生物携手第二军医大学，探究了肝的损伤程度、肝细胞衰老和癌变三者的关系，其中转录组测序实验和分析工作由欧易生物完成。该文章主要报道了肝细胞衰老可以通过激活免疫监视抑制癌变，肝的损伤程度决定了肝细胞的命运，即走向衰老或者癌变。

研究结果

1. 鉴别细胞衰老的三种手段，发现严重肝损伤处理后（SALI）细胞衰老程度更高。

2. 比较不同肝损伤程度的小鼠的肿瘤表达水平，发现轻度肝损伤处理（MCLI）的癌变作用更明显。因此，肝细胞衰老可能具有明显的抑癌作用。

3. 通过转录组测序发现诱导细胞衰老后，Hippo信号通路显著富集，巨噬细胞相关基因显著富集。

4. 免疫组化实验发现肝细胞衰老激活了免疫细胞（如巨噬细胞、CD4 + Th1细胞和NK cells）的表达，表明衰老可能通过激活免疫监视抑制癌变。

参考文献

Wang C, Chen WJ, Wu YF, et al. The extent of liver injury determines hepatocyte fate toward senescence or cancer. Cell Death Dis 2018; 9(5): 575. (IF: 5.965)

B.真核生物转录组测序（无参考基因组物种）

推荐测序模式

HiSeq4000, PE150 

10 Gb/每个样本

案例展示

案例一  白鼬基因组序列草图研究

研究背景

白鼬是一个重要的用于研究人类呼吸疾病的动物模型。

研究内容

通过家养白鼬的基因草图组装，构建了2.28 Gb的基因组序列；对21个白鼬组织的转录组测序，注释了19910个蛋白编码基因；不同时间点用2个病毒感染42个寄主，并取气管和肺组织进行转录组测序研究了寄主的相关反应；用16个囊性纤维疾病的芯片数据，揭示CFTR敲除白鼬其肺器官早期的转录组变化，并可应用于具有囊性纤维疾病的人类婴儿的研究。

图1- 白鼬和人中蛋白序列和组织特异性表达相似

图2-受流感病毒感染和CF疾病的白鼬转录谱分析

研究结果

1. 对雌性白鼬进行基因组测序，通过ALLPATHS-LG软件进行基因组组装，组装草图的是2.41 Gb；对不同发育阶段和成熟的雄性和雌性组织的24个样本进行RNA-seq，用Ensembl软件进行基因组注释，蛋白基因编码models通过Uniprot哺乳动物和其它的脊椎动物的蛋白序列进行比对和注释；通过注释的蛋白序列构建了系统进化树，发现白鼬属于犬科亚目，系统树分枝的长度表明啮齿类进化枝的快速进化，也说明相对于人和老鼠来说，人和白鼬具有更少的遗传多样性；和基础细胞生理学相关的GO注释富集于存在angular sector的基因，其中排行前百分之二十五的白鼬基因同人更接近，这些富集的GO注释包括核苷酸代谢、细胞核分裂、表达调控和蛋白修饰及定位。总而言之，白鼬和人的蛋白序列的高度相似性，表明许多白鼬蛋白进化上可能是保守的，同人的同源蛋白具有相似的生物学功能。

2.通过比较白鼬和人转录丰度的模式研究两者的基因是否具有相似的组织表达。对14个样品的相似表达模式的基因进行聚类分析，结果析表明两者基因的表达模式具有高度一致性和组织特异性；序列比较显示相对于白鼬其它的基因来说，白鼬大脑、骨骼肌肉/心脏、肺和肾里的转录因子和人的同源基因显示更大程度上的相似性，表明这些基因功能调控的高度保守性。

3.由于人和白鼬呼吸道病毒的受体的相似分布，白鼬经常被用作人流感病毒感染的模型。用两种全球流感病毒感染白鼬，在不同时间点收集气管和肺部组织样品做转录组分析，结果表明寄主在气管组织的转录谱变化更加显著，有9869个差异表达基因，而肺部组织只有4646个差异表达基因。进一步分析说明白，鼬基因组资源可以比较受到人类流感病毒感染后的转录组变化，同时揭示这种变化在组织分割区依赖的模式不同。

4.为了研究囊性纤维疾病进程，通过CFTR敲除和正常白鼬的肺组织进行芯片检测，找到的差异表达基因的功能分析主要为血液凝结系统、免疫缺陷信号、5-羟色胺受体信号和辅助性T细胞信号。人和白鼬囊性纤维中相似的表达变化在更广泛的生物学功能上也是明显的，诸如慢性免疫紊乱、吞噬细胞的移动和免疫反应。因此白鼬囊纤维可以作为一个可处理的模型，用于系统性的地研究受伤位点基因表达进程变化，这一点在人中是不可能的。

参考文献
Peng X, Jessica A, Kevin G ,et al. The draft genome sequence of the ferret (Mustela putorius furo) facilitates study of human respiratory disease. Nature biotechnology. 32(12):1250-5.(IF: 43.113)

常见问题

1. 转录组测序是否可以同时检测mRNA、miRNA及其他非编码RNA？
理论上技术是可行的，但是通常会根据测序对象长度的不同，在测序建库的时候会选择不同的片段大小，测序读长也会有不同。一般来讲，如果要进行 microRNA测序的话，通常将microRNA分离出来，单独进行测序。mRNA测序，通常建库时选择200-300 bp大小片段，采用125PE/150PE测序。而长链非编码RNA（lncRNA）存在正向转录和反向转录，所以常采去除rRNA后进行链特异性建库测序原则。

2. 转录组测序需要多少测序量？
由于转录组测序需要进行表达量的分析，因此不推荐使用覆盖度，在确定测序量时，我们以产生的reads数作为依据。转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。

3. Q20、Q30所代表的碱基质量含义？
为了保证数据质量，要在信息分析前对原始数据进行质量评估。每个碱基测序错误率是通过测序碱基质量值（Phred score，Qphred）通过公式转化获得，而测序质量值是在碱基识别过程通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算获得的，对应关系如下表所显示： 

Q20：原始数据中Phred数值大于20的碱基数量占总碱基数量的百分比。

Q30：原始数据中Phred数值大于30的碱基数量占总碱基数量的百分比。

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