MBS (mapping-by-sequencing)

MBS (mapping-by-sequencing)

MBS是针对有参考基因组的物种，利用混合分组分析（BSA , bulk segregant analysis）结合全基因组重测序，测序数据比对到参考基因组，将鉴别到的分子标记与性状进行共分离分析，对锁定到的目标区间内的基因进行功能注释，实现性状决定基因的快速定位。

欧易特色
与传统的图位克隆相比，耗时短、成本低、定位更准确  
根据每个客户的研究目标和内容灵活定制研究方案  
提供标准和高级生物信息分析，可根据客户需求提供个性化数据分析  
欧易生物已成功完成拟南芥、水稻等多个物种突变体定位项目

案例展示
案例一  GA2氧化酶调控水稻抗倒伏性状

研究背景
半矮秆性状对提高作物的抗倒伏能力及增加产量具有重要的意义。自20世纪60年代“绿色革命”以来，培育半矮杆水稻主要是利用赤霉素合成基因SD1的等位突变体。水稻中已陆续报道了60多个矮杆及10个半矮杆突变体，但这些突变体还伴随着其他不利的农艺形状，如极矮小，籽粒短小及雄性不育等。SD1仍然是目前能够用于抗倒伏遗传改良的基因，极大的限制了分子育种的发展。因此，挖掘新的抗倒伏遗传资源势在必行。

研究内容
SV14是一个在水稻育种上被广泛应用的温敏不育系，它的茎秆基部节间显著缩短，显示良好的抗倒伏能力。研究者通过遗传分析发现，SV14茎秆基部节间缩短是由单一基因控制的半显性遗传性状，并将该基因命名为Shornted Basal Internodes（SBI）。结合图位克隆和基因组技术，研究发现SBI编码一个尚未报道的GA2氧化酶，在茎秆基部节间高表达。酶功能分析证明，SBI编码的GA2氧化酶可以将活性赤霉素转化为非活性赤霉素化合物。水稻中SBI存在两个等位变异基因型，导致SBI酶催化活性显著不同。高活性的SBI位点使得水稻茎秆基部节中活性赤霉素含量显著降低，从而抑制基部节间的伸长。体内和体外研究结果证明，位于SBI蛋白序列保守区域的第338位氨基酸的差异是影响SBI酶活性的关键位点。通过对大量水稻品种基因分析发现，该位点的变化影响水稻品种株高及茎秆基部节间长度。同时，基因演化分析表明SBI等位基因之间的差异很可能来自于不同祖先的野生稻群体。
本文全基因组测序及MBS由欧易生物提供技术服务。

研究结果
1. 半矮秆水稻品种SV14来自于在中国湖南省广泛种植的温敏不育系Zhu1S，具有较好的抗倒伏能力。统计数据显示，SV14的一至五茎秆基部节间长度相比Zhu1S显著缩短，并且其第五节间的细胞伸长严重受阻。
2. 通过遗传分析发现，SV14茎秆基部节间缩短是由单一基因控制的半显性遗传性状，并将该基因命名为Shornted Basal Internodes（SBI）。将SV14和Zhu1S杂交，利用MBS技术对F2进行混池测序，找到了SBI的候选基因，其编码一个GA2氧化酶（GA2ox），在茎秆基部节间高表达。序列比对后发现，在SV14和Zhu1S的SBI候选基因共存在6个SNP，其中D308和G338两处导致氨基酸变异。将来自于SV14的SBI候选基因导入中花11，表现出严重的矮化表型。而导入Zhu1S的SBI候选基因，矮化效应并不显著。
3. 体外酶活实验证明，SV14的SBI表现出更高的GA2氧化酶活性。体内分析表明，相比于Zhu1S，SV14的茎秆基部节间中活性GA1含量显著降低，而非活性的2β-羟基-GA8含量升高。另外，过量表达SBISV14和SBIZhu1S都能显著降低GA1含量，并提高2β-羟基-GA8含量。但是，SBISV14对GA含量的影响比SBIZhu1S更为显著。
4. 作者分析了Zhu1S和SV14的SBI等位基因中不同差异位点对表型的贡献。其中，第338位氨基酸位于GA2氧化酶蛋白序列的保守区域，而第308位氨基酸位于非保守区。分别将SBID308N and SBIG338R点突变序列导入中花11。表达SBIG338R的转基因植株均表现出严重的矮化表型，而SBID308N植株的高度仅有小幅度下降。同时，这两组转基因植株中，内源活性GA1含量降低，非活性的GA29。SBIG338R对GA含量的影响比SBID308N更为显著。这个结果表明，第338位氨基酸对SBI的活性具有关键的作用。
5. 作者对大量水稻品种基因分析发现，含有SBIR338位点的株系表现出更矮的植株高度，而含有SBIG338株系则植株更高。同时，SBIR338株系比SBIG338株系茎秆表现出更短的基部节间长度。
6．作者利用SBI等位变异培育出了一系列具有合理茎秆节长度结构、高度抗倒伏能力的水稻新品种，这些品种在大面积种植中显示出良好的抗倒伏、高产、广适等特性。

参考文献
Liu C, Zheng S, Gui J, et al. Shortened Basal Internodes Encodes a Gibberellin 2-Oxidase and Contributes to Lodging Resistance in Rice. Mol Plant 2018; 11(2): 288-299. (IF: 8.827)

常见问题

1. MBS混池需要混多少个个体？
质量性状建议50个以上，数量性状建议30个以上。为了缩小定位的区间，混池中的个体越多越好，前提是个体的表型判别尽可能准确。另外，对于数量性状，注意单侧极端池个体占总群体比例不超过10%。
2. 野生型亲本是否也需要进行测序？是否也需要混池？
在分析过程中，需要进行背景噪声的扣除，因此一般都需要提供野生型亲本的基因型数据。如果能提供构建群体的直接亲本，则无需混池；对于无法明确直接亲本的项目，需要对直接亲本世代相近、覆盖整个亲本基因库的多个个体进行混池。
3. 显性性状能否采用MBS来做，如何取材？
可以做，一般要同时对F2代中3:1分离的两种表型分别混池测序，且分离比为3的株系我们建议通过F3代的表型分离来确定F2代的基因型，在这里选取F2代基因型为纯合系的株系测序。

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