转录组测序

转录组是指某个物种的特定组织或细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。高通量转录组测序可以获得大量转录本序列信息，定量基因转录表达水平，获得基因组转录区域及其位点信息等，在基因组序列拼接注释、样品间基因转录差异表达及其功能研究等方面有重要作用。

一、技术路线

1、有参考基因组的转录组分析技术路线

  推荐平台：Illumina HiSeq 2000、Illumina MiSeq

2.    无参考基因组的转录组分析

推荐平台： Roche 454 FLX+

二、生物信息学分析   

1）有参考基因组的转录组

 1.    原始数据整理、过滤及质量评估

2.    转录组测序分析

l  与参考基因组比对

l  蛋白编码基因的表达量分析

l  蛋白编码基因的表达量差异分析

l  差异表达的蛋白编码基因的聚类分析（热图）

l  差异表达基因富集分析（GO、KEGG）

l  SNPs的分析（SNPs鉴定、同义/非同义突变、与已有SNPs数据库比对）

l  可变剪切分析

l  UTR区域鉴定

l  新基因/新转录本分析

3.    根据客户需求进行个性化分析

 2）无参考基因组的转录组

1.    原始数据整理、过滤及质量评估 

2.    转录组测序分析：

l  序列拼装及拼装统计

l  Unigene功能注释

l  Unigene的功能聚类分析（KOG、GO）

l  Unigene的代谢途径分析（KEGG pathway）

l  Unigene的表达量分析

l  Unigene的表达量差异分析

l  差异表达的Unigene的聚类分析（热图）

l  差异表达的Unigene的富集分析（KOG、GO、KEGG）

l  SNPs的鉴定

3.    根据客户需求进行个性化分析 

四、经典案例

案例一 前列腺癌融合基因的鉴定

背景：前列腺癌发病率位于男性恶性肿瘤的首位，并且发病率近年呈上升趋势。前列腺癌有着明显的种族特异性，而其分子生物学机制至今尚未阐明。

目的：利用Illumina平台对前列腺癌及癌旁组织进行系统研究。

结论：前列腺癌的融合基因具有种群特异性，在欧美人群中普遍高频表达（50-80%）的融合基因TMPRSS2-ERG在中国人群中的表达率仅有20%左右，而在欧美人群中尚未发现的融合基因CTAGE5-KHDRBS3和USP9Y-TTTY15在中国人群中却有很高的表达频率，分别为37%和35.2%。

[ Ren S, Peng Z, Mao JH, et al. RNA-seq analysis of prostate cancer in the Chinese population identifies recurrent gene fusions, cancer-associated long noncoding RNAs and aberrant alternative splicings. Cell Research, 2012, 22(5): 806-821 ]

案例三 玉米不同发育阶段的转录组研究

背景：在单子叶植物中，分生组织分化产生叶片和叶鞘。玉米叶片发育的整个顺序都是沿着长度分布的，不同的部位也呈现出不同的发育阶段。

目的：采用Illumina测序平台对玉米叶片转录组进行分析，了解基因结构和表达差异。

结论：定位了超过120 Mb条序列，定量叶片各发育阶段中成熟维管束鞘和叶肉细胞中的转录本丰度，发现在发育各个阶段的维管束鞘和叶肉细胞中分别有64%和21%的基因差异表达。同时发现一个动态转录组，其中叶基部初级细胞壁和基本细胞代谢的转录本向顶端次级细胞壁生物合成和C4光合作用的转录本转变。

[ Li PH, Ponnala L, Gandotra N, et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature genetics, 2010, 42(12): 1060-1067 ]

案例四 对于未知基因组的西葫芦进行转录组研究

背景：西葫芦属于葫芦科，富含维生素等营养成分，是一种重要的蔬菜，然而，与其相关的研究报道较少，限制了分子育种的发展。

目的：采用Roche 454 FLX对西葫芦的根、叶、花等组织进行转录组测序，分析SSR和SNPs位点。

 结论：通过从头组装获得平均长度为626 bp的unigene 49,610条。发现超过60%的unigene被注释分类到一个或者多个GO分类信息中。在检出的SSR中共有1,882种基序类型和9,043个SNP位点。大量的分子标记，为遗传性状和数量性状位点分析发挥了重要的作用。

[ Blanca J, Cañizares J, Roig C, et al. Transcriptome characterization and high throughput SSRs and SNPs discovery in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae). BMC genomics, 2011, 12(1): 104-119 ]

四、    常见问题解答

1、Q: 转录组测序与其他方法相比有哪些优势？

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途