iTRAQ/TMT蛋白组学

iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术是分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术。不同标记试剂与来源于不同样品胰酶消化后的肽段结合，经过色谱分离，并通过一级质谱和二级质谱。平衡基团在二级质谱时发生中性丢失，而报告基团在二级质谱低质量区域产生多个报告离子，其信号强度分别代表该标记样品的表达量，根据报告离子的峰面积计算同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值，从而实现蛋白的相对和绝对定量。

研究流程：

应用范围：
生物医学
基础研究：生理、病理、药物作用机制
临床诊断研究：Biomark发现、药物筛查
精准医疗：药物开发、个体化治疗
生命科学研究
植物生物学：抗逆胁迫机制，生长发制，育种保护研究等
畜牧业：肉类及乳品质研究，致病机理研究等
食品营养：储藏条件优化，品质鉴定，安全监检测等

帕诺米克优势：
使用全球顶尖仪器设备Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos进行检测；
具有2-10 plex标签，可同时标记2-10组样本进行表达差异分析；
是一种体外标记技术，可标记动物、植物、微生物、临床、体液或细胞等多种样本；
不同标签混合后上机，具有较好的平行性，避免技术误差，提高检测效率；
与凝胶方法相比，iTRAQ可发现膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白、强碱和强酸蛋白以及小于10KD和大于200KD的蛋白质，对低丰度蛋白质亦有较好的检出率。

样本要求：
动物组织 ≥ 100mg、植物组织 ≥100mg、微生物 ≥ 20mg；
细胞 ≥ 10⁷个
细胞培养液上清蛋白：10 cm培养皿一盘
细胞液培养液外泌体：15 cm培养皿一盘
蛋白提取物 ≥100µg
体液：血清/血浆 ≥ 200µL、尿液 ≥ 10ml、唾液 ≥ 500µL、脑脊液 ≥ 1ml、泪液 ≥ 0.1mL、支气管灌洗液 ≥ 3ml；
外泌体 ≥ 10微升，PBS存储
FFPE石蜡包埋切片 ≥ 0.3 mm * 0.3 mm
样本的保存：液氮 或 -80℃保存
样品运输：干冰运输

生物学重复：
为排除个体差异，建议对于临床样品，生物学重复 ≥ 6；对于培养的细胞、微生物、动物模型及植物，生物学重复 ≥ 3。

分析内容：

1. 蛋白鉴定总览

2. 数据标准化

3. PCA主成分分析

4. 蛋白功能GO二级注释分类

5. 蛋白功能KEGG注释

6. 差异蛋白筛选

7. 差异蛋白火山图

8. 差异蛋白热图

9. 差异表达基因GO功能分析

10. 差异表达基因Pathway功能分析

11. 差异基因蛋白互作分析

案例分享：
基于iTRAQ蛋白质组学分析真菌Verticillium dahliae对自噬介导的拟南芥免疫反应
发表时间：2018年
期刊：Autophagy
影响因子：11.059
     植物的自噬和先天免疫之间的功能联系的机制仍不清楚。本研究通过iTRAQ对比Verticillium dahliae感染后的野生型拟南芥（WT）和自噬缺陷型（atg10-1）植株，以大丽轮枝菌-拟南芥为互作体系，利用细胞自噬突变体进行比较蛋白质组学和细胞学分析，发现自噬参与了V. dahliae感染拟南芥防御反应的激活，自噬会促进周维管细胞的分化转移和木质部增生，对抵抗维管病有至关重要的作用。

     图1 拟南芥对大丽花感染反应的蛋白

     图2 差异表达蛋白GO功能注释对差异蛋白的注释分析

参考文献：
Wang F X et al., iTRAQ-based proteomics analysis of autophagy-mediated immune responses against the vascular fungal pathogen Verticillium dahliae in Arabidopsis[J]. Autophagy, 2018, 14(4):1-49.

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途