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上海维景生物科技有限公司
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小鼠XX细胞药物干预后两种蛋白的***酸化酪氨酸水平检测
实验分组：小鼠XX细胞，按下面分组进行药物干预培养，并收集细胞进行免疫沉淀实验。
| 1 | 正常对照组 |
| 2 | 高糖组 |
| 3 | 高糖+E药物 |
| 4 | 高糖+A药物(25μM) |
| 5 | 高糖+A药物(50μM) |
| 6 | 高糖+A药物(100μM) |
| 7 | 高糖+A药物(100μM)+B药物（1mM） |
| 8 | 高糖+C药物(25μM) |
| 9 | 高糖+C药物(50μM) |
| 10 | 高糖+C药物(100μM) |
| 11 | 高糖+C药物(100μM)+B药物（1mM） |
| 12 | 高糖+D药物(25μM) |
| 13 | 高糖+D药物(50μM) |
| 14 | 高糖+D药物(100μM) |
| 15 | 高糖+D药物(100μM)+B药物（1mM） |
免疫沉淀过程
实验试剂：
A抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；B抗体（santa cruz，IP浓度 1:100）；Protein A+G Agarose（上海维景生物）
蛋白样品的准备：
1).对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用嘉美生物Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。 2).对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 3).对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注意事项：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
去除非特异性结合：
1).取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。2).2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注意事项：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
免疫沉淀：
采用A蛋白抗体，B蛋白抗体沉淀蛋白。1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 2）.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。3）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。 5）.完成zei后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 6）.100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品可测定浓度或者用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
Western blot检测
实验试剂：
Phosphotyrosine抗体( Millipore, #05-321, 1:500)；Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP(ZYMED, #62-64201,1:40,000-100,000)
实验设备：
① 电泳电源：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；② 电泳仪及附件：Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)；③ 电转仪及附件：Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)；④ NC膜：PIERCE，Catalog#88018；⑤ 滤纸：Whatman,3MM CHR
实验步骤：略
实验结果：目的蛋白检测，取以上沉淀下来蛋白混合液处理后，每孔点样15ul。
注：SDS-PAGE凝胶浓度为12%；阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p-A蛋白 | 19.415 | 79.179 | 81.869 | 64.923 | 64.544 | 38.742 | 76.364 |
| 样本NO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 | Lane 8 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p- A蛋白 | 66.048 | 38.485 | 24.444 | 41.068 | 50.312 | 57.092 | 42.603 | 94.83 |
| 样本NO | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 |
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p- B蛋白 | 19.37 | 61.188 | 56.7 | 47.383 | 42.308 | 16.953 | 75.589 |
| 样本NO | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 | Lane 8 |
| Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
| p- B蛋白 | 70.891 | 38.042 | 43.421 | 29.656 | 64.184 | 25.98 | 41.653 | 77.76 |
| 样本NO | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 |
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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途
