荧光差异双向电泳技术（DIGE）

       服务简介

      DIGE即荧光差异凝胶电泳，是在双向电泳的基础上，使用三种荧光染料（Cy2、Cy3、Cy5）标记不同组别的蛋白，并在同一张凝胶上对标记的3种蛋白混合物同时进行电泳的多路线分离技术。其中Cy3和Cy5分别标记两组样本的蛋白，Cy2标记所有组别蛋白的混合物，作为内参使用。电泳分离后，在激光扫描仪中用三种不同波长的激光进行扫描，在同一张凝胶中可得到3组蛋白的图谱。利用比对软件，给出各组间蛋白的准确定量信息；借助于质谱仪，还可定性差异蛋白.

       技术优势

1、灵敏度高，zei低可检测到125pg的蛋白质
2、高效性，在一块凝胶上可同时电泳2个实验样品 

3、线性范围广，动态范围高达10^-5
4、定量精确, 引入内参消除了凝胶间的误差，显著提高了实验的精确度和可重复性
5、统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件自动分析，降低了操作者之间的偏差

       服务内容

1、蛋白提取与定量                     4、凝胶图像分析

2、双向电泳预实验                     5、质谱检测

3、DIGE凝胶分离蛋白质              6、数据库检索

      图像示例

     A：寄生虫，B：植物根，C：植物花柱，D：大鼠肝脏组织，E：细菌膜蛋白，F：羊皮肤细胞

      图像分析

      成功服务案例

【研究目标】

弓形虫是一种原生动物型病原生物，能寄生几乎所有的温血动物和人类，引起严重的人畜共患弓形体病。弓形虫有三个感染性阶段的弓形：速殖子、缓殖子和虫卵，速殖子是快速繁殖的阶段，也是主要的病原因子。弓形虫有4种类型，I, II, III和12型，这4种类型的弓形虫感染动物和人类的机制不同。I, II, III型弓形虫研究较多，而12型研究较少。但是在中国，12型弓形虫中的ToxoDB 9是主要的病原体，分布广泛、传播速度快。2D DIGE是一门较精确的定量蛋白质组学技术，采用DIGE比较4种类型的弓形虫速殖子的蛋白质表达差异，期望能为4种类型弓形虫的感染机理研究提供参考。

【实验流程】

1、分别用Type I-RH, Type II-PRU, Type II-TgQHO, ToxoDB 9-TgC7感染小鼠，之后杀死小鼠，收集4种弓形虫的速殖子；

2、裂解4种弓形虫的速殖子，收集总蛋白；

3、用不同的Cy染料标记不同弓形虫的总蛋白，每2种为一个组合，并与内标一起上样于同一张胶；

4、二维电泳分离蛋白质；

5、Typhoon 9400 Variable Mode成像器采集双向电泳后的凝胶图片，在3种不同波长的激发光下，同一张凝胶呈现3种不同颜色的图片（3种Cy染料在不同的激发光下发出不同颜色的光），采集图片；

6、DeCyder Differential Analysis Software分析第5步中的图片，找到差异斑点；

7、挖取差异斑点进入MALDI-TOF/TOF质谱，进行蛋白质鉴定；

8、对鉴定的蛋白质进行生物信息学分析。

【实验结果】

利用DIGE技术分析Type I-RH, Type II-PRU, Type II-TgQHO, ToxoDB 9-TgC7速殖子的蛋白质差异，找到110个差异表达的蛋白质点，其中98个蛋白点被质谱鉴定出属于56种蛋白质，这些蛋白包括表面抗原 （SAG1) 、热休克蛋白70 (Hsp70）、二硫键异构酶、冠蛋白、热休克蛋白60（Hsp 60）、丙***酸激酶、活化C激酶受体1、和过氧还蛋白。之后又对差异蛋白进行了生物信息学分析，GO富集分析表明这些差异蛋白参与了生物调控、代谢、应激反应、抗氧化等过程，KEGG分析表明某些差异蛋白参与了糖酵解/糖异生途径。

【参考文献】

Zhou, D.H. et al. Comparative proteomic analysis of different Toxoplasma gondii genotypes by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis combined with mass spectrometry. Electrophoresis 35, 533-45 (2014).

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