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基于Zeno SWATH®DIA技术的高通量高覆盖血液蛋白质组学分析方案
血液蛋白质组表征对临床蛋白质组研究，尤其是生物标志物发现研究具有重要意义。血液样本因其具有极宽的蛋白质丰度范围以及高度复杂性等特点，给血液蛋白质组深度覆盖和高通量分析带来巨大挑战。
Zeno SWATH® DIA技术融合了ZenoTM trap和SWATH® DIA技术。ZenoTM trap通过提高占空比>90%，从而提高MS/MS灵敏度，可获得更好的二级谱图质量以及重现性。SWATH® DIA采用Q1可变窗口采集，根据离子分布情况，使得每个隔离窗口中离子强度分布更均匀，同时能够获得扫描范围内所有母离子和子离子碎片信息。作为一种数据非依赖型采集（Data-Independent Acquisition）技术，Zeno SWATH® DIA技术可在更短的时间内获得更高的蛋白质鉴定深度，更精准的蛋白质定量信息。该技术将为血浆蛋白质组高通量、深度覆盖研究带来新的提升和变革。
本方案应用Zeno SWATH® DIA 技术对经n-LAPE/MS方法处理的人血浆样本进行蛋白质组数据采集，结合DIA-NN软件进行数据检索，建立快速、高通量分析流程，实现对血浆蛋白质组的深度覆盖分析。
方案主要特点：
► 1. ZenoTM Trap技术通过提高占空比>90%，大幅度提升二级灵敏度，从而提高二级谱图质量以及获得更好的重现性。 ►2. Zeno SWATH® DIA融合ZenoTM trap技术和SWATH® DIA。SWATH® DIA采集技术采用Q1可变窗口采集，使得每个隔离窗口中离子强度分布更均匀，同时获得扫描范围内所有母离子和子离子信息，该技术获得的数据重现性好，在更短的时间内获得更高的蛋白质鉴定深度，蛋白质定量更精准。 ► 3. DIA-NN软件为蛋白质鉴定和定量提供分析工具，可对Zeno SWATH® DIA数据进行library-based和library-free分析，实现快速的高通量蛋白质组学分析。 ► 4. 整合Zeno SWATH® DIA技术、样本前处理技术以及DIA-NN软件，30min梯度时间可获得血浆样本超过5500个蛋白质鉴定数量，同时所获得的数据具有高的稳定性以及良好的定量平行性。
实验方法：
样本：两组人血浆混样样本，40µL血浆样本经n-LAPE/MS方法[1]处理，蛋白质酶解，肽段进样量为400ng。 液相方法：ACQUITY UPLC M-Class液相系统（Waters）。A相: 0.1%甲酸，水，B相: 0.1%甲酸，乙腈。流速: 5ul/min。洗脱梯度: 0-30min, 5%-45%B; 30-34min, 45%-80%B; 34-37min, 80%B; 37-39min, 80%-5%B; 39-40min, 5%。 质谱系统：ZenoTOFTM 7600 （SCIEX），采集模式Zeno SWATH® DIA。 数据处理：DIA-NN软件（version 1.8）[2] 。数据库为人细胞样品通过高pH反相分级并应用Zeno DDA进行数据采集构建的数据库[3]。
实验结果：
1．Zeno SWATH® DIA数据采集 采用Zeno SWATH® DIA采集技术对两组样本进行数据采集。总离子流图结果显示，在液相梯度时间内多肽得到有效分离，重复采集的数据在质谱信号响应以及色谱峰形等具有较好的一致性和重叠性（图1）。 图1. Zeno SWATH® DIA数据采集总离子流图
2. Zeno SWATH® DIA数据分析
利用DIA-NN软件进行library-based数据检索。两组样本鉴定到的蛋白质数量均超过5500个，鉴定肽段的数量超过25000条（图2-A），韦恩图分析显示，两组样本共同鉴定到的蛋白质6231个，蛋白质交集比例达93.% （图2-B）。相关性热图分析显示，同一个样本重复采集的数据相关性均在0.99以上（图2-C）。相比于传统的数据依赖型采集IDA（Information Dependent Acquisition）技术，Zeno SWATH® DIA技术获得了对血浆蛋白质组更高的覆盖深度，而且具有更好的稳定性以及良好的定量平行性。 图2. 蛋白质鉴定、定量结果. A.鉴定蛋白质、肽段柱状图; B.两组样本鉴定蛋白质韦恩图分析; C.相关性分析热图 3．与人血浆蛋白质组计划（Human Plasma Proteome Project, HPPP）数据集的比较 将两组样本鉴定到的蛋白质与HPPP数据库[4]进行比较分析，其中可匹配到HPPP数据库的蛋白质2525个（图3-A），这些蛋白质涵盖了血液中常见的中、高丰度蛋白质，如血清白蛋白（Albumin）、巨球蛋白（Alpha-2-macroglobulin）、补体C3（Complement C3）、载脂蛋白B（Apolipoprotein B）、补体因子H（Complement factor H）等，更关键的还覆盖到了许多蛋白浓度≤10ng/ml的低丰度蛋白质，如类血管动蛋白-1（AMOL1，0.1ng/ml）、细胞骨架相关蛋白5（CKAP5，0.4ng/ml）、血小板活化因子乙酰水解酶β（PA1B3，0.3ng/ml）等，甚至更低丰度的蛋白质，如E3 泛素连接酶RNF213（RN213，3.5 pg/ml）（图3-B）。此外，应用Zeno SWATH® DIA技术结合n-LAPE/MS样本前处理技术，本数据中特有鉴定蛋白质超过4200个，这些数据进一步丰富和扩大了人血浆蛋白质组数据集，为疾病生物标志物发现和筛选、疾病分子机制、药物靶点发现、临床转化等研究提供更多新的、有价值的依据和信息。 图3. 与HPPP数据集比较分析 A.与HPPP数据集比较韦恩图； B. 鉴定到的血液蛋白质含量总体分布
以上结果表明，应用Zeno SWATH® DIA技术结合血浆样本前处理技术，可实现对血浆蛋白质组的深度覆盖，鉴定到的血浆蛋白质含量跨度超过8个数量级。此外，获得的蛋白质组数据具有高的稳定性和良好的定量平行性，展现了Zeno SWATH® DIA技术对于血液蛋白质组高通量高深度分析的无限潜能。
文献✦
[1] 马聪聪等. 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数据的方法.申请号：202111243949. [2] Demichev V, Messner CB, Vernardis SI, Lilley KS, Ralser M. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods. 2019. 17, 41-44. [3] Large-scale protein identification using microflow chromatography on the ZenoTOF 7600 system. SCIEX community post, RUO-MKT-18-14415-A. [4] Deutsch EW, Omenn GS, Sun Z, Maes M, Pernemalm M, Palaniappan KK, Letunica N, Vandenbrouck Y, Brun V, Tao SC, Yu X, Geyer PE, Ignjatovic V, Moritz RL, Schwenk JM, Advances and Utility of the Human Plasma Proteome, J Proteome Res. 2021 Dec 3;20(12):5241-5263.