鉴定高达19000个蛋白质！揭秘Zeno SWATH DIA深度全景质谱采集方法

概述

蛋白质组学的核心目标是表征蛋白质，对蛋白质的鉴定和定量其相对丰度或在动态环境中蛋白质的丰度变化，有助于进一步了解是其在生物体中的生物学功能以及其在细胞内功能和疾病状态中所发挥的作用。Zeno^™ SWATH^® DIA作为一种数据非依赖性采集技术，广泛应用于蛋白质组学研究。该技术具有快速的采集速度，结合Zeno^™ trap技术提高二级质谱灵敏度，可在不了解样本的情况下，应用于不同样本量和不同梯度下蛋白质的鉴定和定量^1,2。近年来，随着纳升流速色谱柱性能改进，通过优化纳升流速色谱分离，特别是其更窄的液相峰形，更小的死体积和对复杂的多肽混合物的分离，实现了质谱性能的最大化。

本文在ZenoTOF^® 7600 系统上应用IonOpticks Aurora SX色谱柱进行纳升流速色谱分离，通过Zeno SWATH DIA分析，在接近单细胞蛋白质水平的低样本量(250pg)复杂标准品中，检测出超过2300个蛋白质 (>10,000个前体离子)，显示了高的灵敏度。3个不同物种(human, yeast和E.Coli )的酶解产物按照不同的比例混合，在该混合样本中检测到超过19000个蛋白质，其中94%的蛋白质定量CV小于20%。同时，通过Zeno SWATH DIA非标记定量准确的定量了混合物中蛋白质定量比值。该结果展示了蛋白质鉴定和定量灵敏度达到新的高度，突出了ZenoTOF 7600 系统在进行极具挑战的蛋白质组学研究中的能力。

使用IonOpticks Aurora SX 

纳升流速色谱柱结合

Zeno SWATH DIA分析的主要特点

1解锁对复杂蛋白质组混合物强大的非标记定量能力：

90min纳升流速液相梯度，从500ng human/yeast/E.Coli )混合样本中鉴定到超过19000个蛋白质（>145000个前体离子），其中94%蛋白质和超过88%的前体离子定量CV<20%。

2单细胞水平进样量的灵敏度：

30min纳升流速LC梯度，从250pg K56样本中鉴定到超过2300个蛋白质（>10000前体离子）。

3突破更高进样量蛋白质检测边界：

90min纳升流速LC梯度，从200ng K562样本中鉴定到8400个蛋白质（80000个前体离子）。

图1. 应用Zeno SWATH DIA对来自三个物种混合样本（500ng）鉴定和定量的蛋白质（A）和前体离子（B）。样本A中三个不同物种酶解产物所占比例：65%人，30%酵母和5%大肠杆菌。样本B中三个不同物种酶解产物所占比例：65%人，30%酵母和20%大肠杆菌。

应用Zeno SWATH DIA技术

突破蛋白质覆盖深度边界

两份按照不同比例混合了human、yeast和E.Coli 酶解产物的混合样本（500ng），进行30min纳升流速分析，从A和B样本中分别鉴定到15853和16260个蛋白质（图1A）。60min和90min液相梯度，样本A蛋白质鉴定数量分别对应17900和18622个，样本B蛋白质鉴定数量分别是18363和19105个，其中95%蛋白质定量CV小于20%，该结果展示出极高的定量重现性。30min液相梯度，样本A和B分别检测到109120和110673个前体离子。60min和90min液相梯度，样本A前体离子鉴定数量分别提升到134123和145572个，样本B前体离子的鉴定数量分别提升到16390和147248个。88-90%的前体离子定量CV<20%（图1B）。

两个混合样本鉴定到的蛋白质中，三次重复检测均有MaxLFQ值且CV<20%的蛋白质用于散点图绘制。图中的散点总共对应17879个蛋白质（human 13187个、yeast 3705个、E.Coli 987个）。如图2所示，两个混合样本间每个物种蛋白比值与理论比值一致，该结果展示了Zeno SWATH DIA数据定量精密度和准确性。

图2. 使用Zeno SWATH DIA进行非标记定量并计算其蛋白质比值。来自三个不同物种的酶解产物混合的两份样本，通过Zeno SWATH DIA进行分析，90min梯度，每个样本进样500ng。DIA-NN软件检索获得MaxLFQ并进行蛋白质定量比值计算，结果显示与理论比值一致：human（1:1,Log2(A/B)=0），yeast (2:1, Log2 (A/B) = 1), E.Coli (1:4, Log2 (A/B) = -2) 。右侧箱型图显示了高的精密度和准确度。

为进一步测试蛋白质覆盖深度，200ng K562样本分别进行30min、60min和90min液相梯度分析，分别鉴定到7862、8312和8383个蛋白质，其中95-96%的蛋白质定量CV<20%（图3A）。前体离子鉴定个数分别为72594、79552和80866个，其中88-92%的前体离子定量CV<20%（图3B）。

总而言之，这些数据超越了此前在ZenoTOF 7600 系统上使用Zeno SWATH DIA进行蛋白质和前体离子鉴定的边界。同时该技术与高效色谱分离相结合，展现了优异的定量性能。

图3. 200ng K562酶解样本进行Zeno SWATH DIA分析，鉴定和定量CV小于20%的蛋白质（A）和前体离子（B）。

应用Zeno SWATH DIA

突破低进样量时

蛋白质检测灵敏度限制

为进一步展示Zeno SWATH DIA在低进样量时的性能，应用IonOpticks Aurora UltimateSX 色谱柱，对不同进样量的K562样本进行30min纳升流速梯度分析。如图4所示，在低进样量（<1ng）时，38 vw Zeno SWATH DIA可增加蛋白质鉴定数量，且定量CV<20%的蛋白质百分占比更高。250pg进样量时，鉴定到2361个蛋白质（其中1587个蛋白质定量CV<20%）。更高进样量（>5ng）时，85 vw Zeno SWATH DIA获得更高的蛋白质鉴定数量。虽然38 vw Zeno SWATH DIA方法蛋白质鉴定数量不高，但其定量<20%的蛋白质占比仍然很高，表明更长的二级质谱的累积时间可提供更好的定量数据质量。图6展示了低进样量（250pg, 500pg和1ng）Zeno SWATH DIA方法定量蛋白CV%分布。CVs中位数随着样本进样量增加而提高。

图4. 应用Zeno SWATH DIA分析K562酶解样本, 30min梯度，不同样本量下鉴定和定量CV<20%的蛋白质。

图5. 应用Zeno SWATH DIA分析K562样本, 30min梯度，不同样本进样量下鉴定和定量CV<20%的肽段。

图6. 使用Zeno SWATH DIA对低上样量人K562酶解产物鉴定到的蛋白质CV%分布。实线表示每一种条件下CV中位数，虚线表示四分位水平。

为进一步提高低样本量鉴定的可信度，图7展示提取了两条不同肽段（来自ENO_HUMAN protein 的肽段LNVTEQEK，来自EF1A3_HUMAN protein的肽段IGGIGTVPVGR）碎片离子提取离子流。两条肽段3次重复完整连续y离子XIC，该结果展示了优异的重现性。两条肽段MS/MS谱图中可见突出显示的大部分y离子和b离子碎片。图8总结了碎片离子XIC峰面积定量重现性，图中汇总了每条肽段响应值前3的碎片离子XIC峰面积。每个碎片离子整合3次重复实验计算得到平均峰面积，同时计算CV%值。所有离子对CV%值均≤5%，该结果显示了即使在极低样本量水平下Zeno SWATH DIA优异的定量能力。

图7. 250pg K562 Zeno SWATH DIA二级质谱图灵敏度。图中展示了来自酶解产物的两条代表性多肽(A, LNVTEQEK from ENO_HUMAN; B, IGGIGTVPVGR from EF1A3_HUMAN)。A和B图中上半部分展示了3次重复肽段所有y离子XIC。底部展示每一条肽段Zeno SWATH DIA二级谱图，标注的为主要的碎片离子。在该进样水平下，可见优异MS/MS谱图质量和三次重复重现性。

总结

1使用 IonOpticks Aurora SX 系列纳升流速色谱柱和Zeno SWATH DIA，从500ng human/yeast/E.Coli 混合样本中鉴定到 >19,000个蛋白质（>145,000条肽段）。

2不同物种的混合物，无论在重现性 (即蛋白质和前体CVs <20%的比例)，或是使用Zeno SWATH DIA进行无标记定量并计算蛋白质定量比值，均取得了出色的定量性能。

3使用IonOpticks Aurora纳升色谱柱和Zeno SWATH DIA，从200 ng K562 样本中鉴定出约 8400个蛋白质（约 80000条肽段），其中>95%的蛋白质定量CV <20%。

4利用Zeno SWATH DIA，30min纳升流速梯度，从250 pg K562样本中鉴定到 > 2300个蛋白质 (> 10000条肽段)，突出了ZenoTOF 7600系统在单细胞蛋白质组学应用中的灵敏度。

文献

1. Flexibility, speed, and throughput for high proteome coverage using Zeno SWATH data-independent acquisition (DIA) coupled with the Evosep One system.

SCIEX technical note, RUO-MKT-02-15461.

2. Quantifying 1000 protein groups per minute of microflow gradient using Zeno SWATH DIA on the ZenoTOF 7600 system. 

SCIEX technical note, RUO-MKT-02-15429-A.

3. Assessment of ZenoTOF 7600 system robustness for quantitative proteomics workflows. 

SCIEX technical note, MKT-28411-A.

4. Label-free protein quantitation of protein mixtures using Zeno SWATH DIA. 

SCIEX technical note, MKT-28641-A.

5. Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. 

Nature Methods, 17, 41-44.

6. Large-scale protein identification using microflow chromatography on the ZenoTOF 7600 system.  

SCIEX technical note, RUO-MKT-02-14415-A.

7. Cox, J et al. (2014) Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. 

Mol. Cell. Proteomics 13, 2513-2526.

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