荧光定量PCR

定义

        荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

       SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，SYBR Green I只有与双链DNA结合才能发出荧光，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加，荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。以SYBR Green I作为检测信号的荧光定量PCR方法称为染料法。

一般实验过程

1）样品RNA的抽提

2）样品RNA质量检测

3）样品cDNA合成

4） 待测样品的待测基因实时定量PCR

5） 电泳检测

如需进行绝对定量RT-PCR，还需制备相应标准品，绘制标准曲线。

样品要求

1、客户提供总RNA或新鲜/冷冻的组织或细胞。须保证：

    1）总RNA无明显降解，总量大于5 mg。如果基因丰度较低或调取的基因较长，为了保证实验顺利，请您提供尽量多的材料。

    2）实验材料必须保证新鲜，请您采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂(如Sample Protector)；

2、请提供目的基因信息。

3、请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA、来源、丰度等。选择合适的时间取样对获得理想的实验结果起着决定性的作用，真核生物基因表达高峰期一般在蛋白理化指标高峰期的前一阶段，请适时选取。

服务内容

1、根据基因序列设计目的基因以及内参基因的引物

2、提取总RNA，通过OD260/280值测定对RNA样本进行定量。

3、将RNA逆转录为cDNA。

4、普通PCR扩增内参基因，以确保逆转录成功。

5、Real-Time PCR(荧光定量PCR)，进行实验结果分析 。

6、实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。

终产品

1、完整的实验报告（实验仪器，实验步骤等）；

2、原始实验数据，软件分析的实验结果，扩增曲线和溶解曲线；

3、交付剩余的实验材料（样品，总RNA，cDNA，引物等）。

 

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途