16S rDNA测序是利用高通量测序技术对样品微生物的16S rDNA扩增产物的片段进行测序，能够对特定条件下细菌种类和丰度进行有效的鉴定。16S rDNA 指细菌基因组中编码核糖体16S rRNA分子对应的DNA序列。16S序列由9个高变区组成，中间是保守区，是最常用的细菌分类标准。通过提取环境样品的DNA，扩增其中16S rDNA基因，可以鉴定绝大多数细菌。基于Illumina MiSeq平台的16S rDNA测序可以一次性完成多个样本的平行测序，可以进行样品中细菌多样性、物种丰度、种群结构和系统进化等诸多信息分析。

 1、实验方案
      测序策略：Illumina MiSeq PE300/PE250
      数据量：每个样>5万条clean reads

2、技术优势
（1）准确性高：从碱基保守水平测定，真实反映物种情况；
（2）快速高效：相比于传统鉴定方法，16S测序鉴定微生物更快速和准确；
（3）过程简单：环境样品的最优解决方案，完全摆脱繁杂的菌株分离工作；
（4）灵敏度高：可以鉴定到低丰度细菌；
（5） 降低成本：需测序数据量少，检测成本低。

3、数据分析
（1）按标准流程进行数据整理及数据质量评估；
（2）Tags拼接、过滤；
（3）物种组成分析（与RDP、Silva、GreenGene等数据库比对）；
（4）OTU统计及venn图分析；
（5）OTU Rank曲线；
（6）物种积累曲线；
（7）物种注释及其丰度分析（柱状图和热图分析）；
（8）物种系统进化分析；
（9）单个样本复杂度分析（α多样性分析）；
（10）样本间/组间α多样性差异统计分析及盒形图；
（11）样品间复杂度分析：β多样性heatmap分析；
（12）β多样性PCoA分析（2D/3D）；
（13）NMDS-2D/3D分析；
（14）样本组间差异分析：Adonis分析，相似性分析，RDA/CCA分析等；
（15）不同样本间物种组成聚类分析（样品数≥3）
（16）其他高级分析：比如PICRUSt预测宏基因组的功能组成。

4、技术流程


5、案例分析
       案例（1）多发性硬化病与肠道微生物组的关系
       肠道微生物对于免疫系统的功能发挥着重要的意义，同时与多种自身免疫疾病相关。Beth Isreal Deaconess医疗中心的人员使用Miseq和454测序仪，通过对60例MS（多发性硬化疾病）患者和43例健康人进行肠道16s rRNA测序并分析，发现MS患者的肠道中Methanobrevibacter和Akkermansia两种菌丰度增高，同时还伴有Butyricimonas的丰度降低。接受治疗后，患者肠道中Prevotella和Sutterella的丰度有所上升，Sarcina有所降低。提示了肠道微生物的菌种改变有助于发现MS起病原因。

图1 MS患者和健康人肠道微生物的差异分析
       案例（2） 红斑狼疮患者兼患牙周炎龈下牙垢16S rDNA测序揭示口腔微生物的多样性
       红斑狼疮是免疫系统疾病，很多患者会同时患有口腔疾病。该研究募集了52例SLE患者（伴有牙周炎35例，无牙周炎17例）和52例非SLE对照（伴有牙周炎28例，无牙周炎24例）；共采集104份龈下牙垢，提取总DNA后，利用Illumina Miseq平台行16S rDNA测序V4区域。SLE患者牙周炎发生地更加普遍且更严重，且年龄更小。SLE会影响口腔微生物的多样性。在患有牙周炎的群体中，SLE患者较对照组口腔微生物多样性低。微生物的相互关系分析中，非SLE对照样本共鉴定到89个细菌关联，而SLE患者样本中共发现了111个细菌关联。

图1 对照组（红色）和非牙周炎SLE样本（绿色）具有不同相对丰度的OTU

参考文献
[1] Jangi et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications, 2016.
[2] Corrêa et al. Subgingival microbiota dysbiosis in systemic lupus erythematosus: association with periodontal status. Microbiome, 2017.

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途