RRBS测序 服务简介

       Reduced Representation Bisulfite Sequencing（RRBS）是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，通过MspI酶识别CCGG酶切位点处理DNA，富集启动子及CpG岛区域，并进行 Bisulfite处理和高通量测序，同时实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点，与基因表达、表型性状息息相关。 RRBS作为一种高性价比的甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

1、实验方案
      测序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000  PE150
      数据量：推荐5G clean data

2、技术优势
（1）精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率，见下表；
（2）重复性好：多样本的覆盖区域重复性高达85%-95%，适合多样本间的甲基化差异分析；
（3）检测范围广： 覆盖全基因组范围内超过5百万个CpG位点；
（4）性价比高：测序区域更有针对性，数据利用率更高。

表1 三种甲基化研究技术比较

甲基化研究方法Bisulfite-SeqRRBSMeDIP-Seq覆盖范围全基因组主要集中在CpG岛和promoter区域全基因组范围，但是倾向于高CpG密度和高甲基化区域原理Bisulfite处理酶切+Bisulfite处理抗体富集分辨率1bp1bp100-1000bp数据量≥30X 基因组3G、5G4G鉴定MDR的数量多多少DMRs的灵敏度高高低插入片段长度200-300 bp40-220 bp200-300 bp价格昂贵便宜便宜

3、数据分析
3.1 标准信息分析
（1）去接头污染，去低质量reads和产量情况统计； 
（2）RRBS序列与参考序列的比对； 
（3）Promoter和CGI（CpG island）覆盖度分析；
（4）Promoter和CGI区的甲基化分析：
（5）甲基化C碱基中CG，CHG 与CHH 的分布比例；
（6）甲基化C的平均甲基化水平； 
（7）不同C碱基类型（CG,CHG,CHH）甲基化水平的分布； 
（8）区域甲基化图谱；   
（9）差异甲基化区域（DMR）的分析。
3.2 高级信息分析
     根据客户的具体研究进行的个性化分析

4、技术流程


RRBS测序 案例分析

       案例（1）UHRF家族蛋白过表达导致肿瘤细胞DNA低甲基化
       细胞DNA低甲基化是肿瘤中最常见的表观改变，但机理不明。研究表明UHRF1调停DNMT1甲基化后的DNA修复。通过RRBS技术，报道UHRF1和UFRF2可以行使E3连接酶功能，促进DNMT3A降解以阻止DNA甲基化的从头合成过程。UHRF1/2通常在肿瘤中呈现过表达，研究表明UHRF1/2过表达抑制了DNMT3A蛋白合成进而导致DNA低甲基化。如果废止对DNMT3A的下调作用或者促使DNMT3A的过表达，则会直接引起DNA甲基化并使得肿瘤生长受损。该研究提出一种工作模型：UHRF1/2守卫DNA甲基化的保真度，通过UHRF1/2过表达抑制DNMT2A进而引起肿瘤中DNA低甲基化的一个因子。

 图1 UHRF2通过负调控DNA甲基化的从头合成进而抑制DNA甲基化



 图2  肿瘤中UHRF1/2过表达与DNMT3A蛋白下调的关系分析
        案例（2）人中性粒细胞基因组DNA甲基化组和转录组谱
       DNA分子甲基化是一种与人类疾病、基因表达和表型变化相关的重要机理。利用RRBS技术，新西兰研究人员分析出在健康个体中DNA的甲基化模式，同时识别了表现出显著个体化差异的基因。研究人员使用illumina GAII和Hiseq2000平台对13个样本进行RRBS测序，共得到633 M条100bp读长的数据。进一步使用illumina HiSeq2000平台对其中四个样本进行RNA-Seq，获得174M 条51bp读长的高质量数据。目前的数据集合可以为一个综合资源利用，以了解在健康个体中表型性状、DNA甲基化导致的疾病易感性以及基因表达模式的本质和机理。

图1 RRBS测序reads的特征和质量
参考文献
[1] Jia et al. Negative regulation of DNMT3A de novo DNA methylation by frequently overexpressed UHRF family proteins as a mechanism for widespread DNA hypomethylation in cancer.Cell Discovery, 2016.
[2] Chatterjee et al. Genome-scale DNA methylome and transcriptome profiling of human neutrophils. Scientific Data, 2016.

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