RNA Immunoprecipitation (RIP) 是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能更有效地发现miRNA的调节靶点。RIP-seq技术使用特异性抗体对RNA结合蛋白或者特殊修饰的RNA进行免疫共沉淀后，分离纯化RNA，通过高通量测序和分析，深度解析与目标蛋白相互结合的RNA的区域或种类。

1、实验方案
      测序策略：Illumina NextSeq 500  SE50
      数据量：20M clean reads

2、技术优势
（1）全转录组覆盖：与RIP芯片相比，可在全转录组范围对蛋白结合位点进行筛选与鉴定；
（2）高灵敏度：每个样本可获得数百万条的序列标签，可发现研究转录组上稀有的蛋白结合位点；
（3）高精确率：可获得高水平的信噪比数据，准确区分真实事件与噪音，精确定位蛋白结合位点；
（4）重复性好：深度测序保证了检测随机性，可不需技术重复。

3、数据分析
3.1 标准信息分析
（1）将reads比对到基因组：将预处理reads与reference genome进行mapping，最后得到mapping的sam结果文件，给出mapping结果统计；
（2）peak detect：应用sam文件进行peak富集区查找；
（3）motif detect：查找结合位点区结构特性，寻找转录因子结合区域的motif结构；
（4）基因关联：应用结合位点区位置，确定其周围所涉及的基因；
（5）关联基因GO差异分析：以参考基因组为背景集对结合位点关联基因进行GO富集分析。

4、技术流程


5、案例分析
       案例（1）Rocaglates把DEAD-box蛋白eIF4A运输到序列选择性翻译抑制物
       Rocaglamide A（RocA）代表一类能够选择性杀伤非整倍体肿瘤细胞和抑制特殊mRNA翻译的蛋白合成抑制剂。RocA作用于真核起始因子4A(eIF4A)，一种ATP依赖性的DEAD-box RNA解旋酶；它的mRNA选择性是作用于高度结构化的5’非翻译区，这一过程高度依赖于eIF4A-调节的解旋反应。然而，美国加州大学分子与细胞生物学系研究人员利用Rip-seq技术研究发现：Rocaglate（药物）治疗也许并不能从表现形式上复制eIF4A活性的缺失导致的缺陷，因为这药物实际上只是增加了eIF4A和RNA的亲和力。特别说明的是5’非翻译区的二级结构对于RocA选择性而言只是一个次要的决定因素，同时该RocA不会通过降低eIF4A有效性来抑制翻译。相反，在体外和细胞中，RocA以ATP非依赖性的方式特异性地将eIF4A夹送到polypurine序列中。本研究通过这个重要的抗癌化合物来阐明了选择性翻译抑制的重要机理。

图1 由RocA选择性翻译抑制导致的作用于eIF4A的RNA序列选择性改变

参考文献
[1] Iwasaki et al. Rocaglates convert DEAD-box protein eIF4A into a sequence-selective translational repressor. Nature, 2016.

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