DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为CpG岛CpG岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

        Herman 等（ 1996 ）在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 
        特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生甲基化。

服务订购

DNA甲基化服务

BSP-10个克隆

DNA提取和亚硫酸氢盐处理

片段扩增+10克隆测序

140元/样品

800元/样本/片段

MSP-电泳法

询  价

询  价

流程
1、样品用Qiagen试剂盒进行基因组 DNA 提取与重亚硫酸盐处理（包括纯化和脱磺基反应）。
2、用甲基化引物设计相关软件在甲基化区域设计 甲基化特异性的引物（ primer Ⅰ ）或非甲基化的引物（ primer Ⅱ ） 引物 2 对。
3、 进行特异性的 PCR 扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。
4、检测 MSP 扩增产物，如果用针对处理后甲基化 DNA 链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对处理后的非甲基化 DNA 链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。

亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
        亚硫酸氢盐修饰后测序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA 甲基化方法，此方法可靠性及精确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态。
        用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
        特点：精确度高，能够准确检测出甲基化的程度百分比。

流程
1、样品用Qiagen试剂盒进行基因组 DNA 提取与亚硫酸盐处理（包括纯化和脱磺基反应），使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
2、用甲基化引物设计相关软件在甲基化区域两端设计引物。
3、进行基因扩增及 PCR 产物回收。
4、PCR 产物直接测序或克隆测序（定量分析），分析每个 CpG 岛甲基化情况 。
5、数据统计分析。与未甲基化的 DNA 样本进行比对。


样品要求

1、DNA样品：浓度≥100ng/ul、体积≥20ul的总DNA样品，DNA抽提：血液20元/样本；新鲜组织30元/样本；石蜡包埋组织50元/样本；
2、血液样品：请提供≥500ul抗凝血；采用标准的采样管， EDTA 抗凝或枸椽酸钠抗凝；
3、组织样品：请提供足量的组织样品（≥300mg）；
4、细胞（≥106 ）；
5、甲基化位点信息：免费提供甲基化岛分析。

提供报告
1、MSP：引物序列、实验报告、包括MSP产物的电泳图片；
2、BSP：引物序列、测序峰图、阳性克隆质粒和实验报告；

甲基化研究思路
寻找甲基化位点
1、甲基化二代测序寻找甲基化位点
对照组和实验组进行甲基化芯片检测，找到相关的甲基化位点；
一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，可预测该基因是否存在CpG岛；
根据文献寻找相关基因的甲基化位点。
2、验证甲基化位点，并进行甲基化程度分析
采用对照组和实验组样本进行甲基化验证；
MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；
BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比；
HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围；
焦磷酸测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比。
3、分析甲基化位点与研究的相关性
根据对照组和实验组样本的检测结果，分析与研究的相关性；
比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异；
比对对照组合实验组相同基因启动子区甲基化程度是否有差异。
4、验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化
采用荧光定量PCR的方法检测相关基因的表达量，如果表达量降低，可能由于启动子区发生甲基化导致的，从而影响该基因所在的某些通路，导致一些疾病，或表型发生变化；如果没有发生变化，可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切，从而不会影响基因的表达。
        DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为CpG岛CpG岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。



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