酵母单/双杂交文库筛选

酵母单杂交文库筛选
一、 实验原理：

真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由DNA结合结构域(DNA—binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体，顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。
基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果，这种结合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性，这是研究顺式作用元件即DNA序列与蛋白质互作的基础。该实验目的是为了确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用；分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因；定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域，以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。
 
二、实验步骤
1.诱饵基因的自激活检测，检测通过后继续下一步实验
2.诱饵质粒转化酵母细胞，验证合格后再转化文库质粒
3.酵母筛选/3AT条件优化
4.筛选结果的测序

三、实验结果：
1. 文库筛选报告（电子版），
2. 文库筛选图片（电子版），
3. 筛选测序结果和阳性克隆实物。

酵母双杂交文库筛选
一、 实验原理：
酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录激活结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。酵母双杂交文库的构建是筛库的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用，是现在分子生物学与生物化学常用的手段。
 
二、实验步骤
1.诱饵基因的自激活和毒性检测，检测通过后继续下一步实验
2.诱饵质粒转化酵母细胞，验证合格后再转化文库质粒
3.筛选结果的测序

三、实验结果：
1. 文库筛选报告（电子版），
2. 文库筛选图片（电子版），
3. 筛选测序结果和阳性克隆实物。

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