杆状病毒载体表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）自1983年问世以来已被广泛用于制备各种重组蛋白，尤其被广泛应用于重组激酶以及蛋白复合物的表达。 凭借其稳定的实验体系、高表达水平及翻译后修饰功能而被普遍认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。拓普生物杆状病毒蛋白表达系统包括实验方案的设计、表达载体构建、病毒制备和规模化的蛋白表达纯化等。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统的特点
1.昆虫细胞表达的重组蛋白具有完整的生物学功能，外源蛋白在细胞内进行正确折叠、为二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白；
2.昆虫细胞体系能进行翻译后的加工修饰，具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等；
3.杆状病毒能容纳大分子的插入片段，能包装大的基因片段，目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限；
4.杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体；
5.昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白；
6.杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时明显优于其它系统。

杆状病毒-昆虫细胞系统可以提供高活力的重组蛋白，解决在其它体系中无法解决的蛋白活性困难。拓普生物采用的是经典的Bac-to-Bac杆状病毒表达体系，可以依据客户的需求设计优化基因序列并设计实验方案。另外，拓普生物配套的免费基因优化服务、蛋白设计分析服务，以及表达方案建议，将为您节省大量的时间和经费。

 

拓普生物杆状病毒表达服务流程

实验设计

客户要求通过杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统以胞外分泌的形式获得目的蛋白，客户提供需要表达蛋白的核酸序列或是GenBank number。公司对客户提供的核酸序列进行蛋白序列分析（亲水性、信号肽序列、昆虫细胞的稀有密码子），判断是否需要对基因的密码子进行优化，加入分泌标签和纯化标签等。公司以PCR扩增或是基因合成的方式构建pFast-bac1-target-gene表达质粒，转化后通过蓝白筛选方法获得重组的Bacmid，经PCR鉴定之后转染sf9细胞，以获得P1代病毒和P2代病毒。侵染后小试表达并通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，对确认有表达的蛋白进行大量表达并通过亲和纯化柱对目的蛋白进行纯化，对纯化好的蛋白进行SDS-PAGE检测蛋白浓度和纯度，质检好的蛋白提交客户。

实验方案

1.重组质粒构建
对PCR扩增或是合成的基因（in pUC57 vector）双酶切连接至pFast-bacI载体对应的酶切位点之间；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆送测序并进行序列分析。

2. 重组Bacmid的构建
(1)DH10Bac E.coli 感受态细胞冰上解冻；
(2)将200ng的pFastBac1-taget载体缓慢加入感受态细胞中，轻轻混匀；
(3)冰上放置30min，然后42℃热击90s；
(4)迅速冰上静止5min；
(5)向EP管里加入900 μl S.O.C.培养基；
(6)37℃，225 rpm震荡摇菌2h；
(7)取100μl菌液涂于含有50 mg/ml 卡那霉素，7 mg/ml 庆大霉素，10 mg/ml 四环素，100 mg/ml X-gal和40 mg/ml IPTG的LB平板，37℃，倒置培养24-48h。

3.重组Bacmid质粒的鉴定
挑取3个白色单克隆菌落接种分别接种于5ml含有50 mg/ml卡那霉素，7 mg/ml 庆大霉素，10 mg/ml 四环素的液体培养基中进行摇菌，摇菌完成后进行质粒小提，PCR验证重组Bacmid的正确性，若目的基因成功转座至Bacmid中，扩增产物的大小应为（2300bp+taget gene length）。

4.Sf9细胞培养
sf9细胞培养使用SF 900Ⅱ培养基培养，一般每3天分瓶传代一次。处于对数生长期细胞且细胞活力大于95%的sf9 细胞用于转染实验。

5.细胞转染
(1) 在六孔板中接种9×105个细胞/2ml/孔。
(2) 27℃培养1h，使细胞贴壁;
(3)  在这期间制备Bacmid与Cellfectin复合物：A. 用100ul培养基稀释1ug Bacmid（约5ul）; B. 用100ul培养基稀释5ul Cellfectin; C. 将上述两种稀释液合并（总体积约210ul），轻轻混匀，室温孵育15~30min;
(4) 在Bacmid与Cellfectin孵率期间，将六孔板中的培养基吸掉，并换上2ml的培养基;
(5) 在含有210ul的复合物的管内加入800ul的培养基，轻轻混匀后加到每个孔中;
(6) 将六孔板内的细胞孵育5h，27℃；
(7) 去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基，在27℃湿度培养箱中进培养。

6.P1病毒液的收集及P2病毒的扩增
当细胞出现细胞核变大、细胞裂解等感染迹象时，收集细胞上清作为P1代病毒（P1的滴度在106pfu/ml左右）；收集细胞沉淀进行WB检测；将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱（短期）。原代病毒滴度(P1)较低，介于1×106~1×107，使用P1感染正常细胞后对病毒进行扩增，扩增后滴度可达到1×107~1×108，一般感染细胞48 h后收集的病毒扩增将近100倍。

7.病毒滴度检测
六孔板中细胞120万/孔，静置培养1h，病毒梯度稀释101 、102 、103 、104 、105 、106 、107 和108 ，去掉六孔板中的上清，取106、107和108三个滴度病毒加入到六孔板中，平行对照2组，孵育1h，配置空斑培养基，每孔加入2mL空斑培养基；第四天加入中性红染色液；7-10天计数空斑数，算病毒滴度。

8.重组蛋白表达纯化及检测
sf9细胞以2×106/ml瓶接种于500ml细胞培养瓶中；待细胞生长至对数期，接P2代病毒感染sf9细胞；48~72h内收集细胞及上清，用于重组蛋白表达的检测。使用商业化的亲和柱对收集的样品进亲和纯化，进行10% SDS-PAGE分析和WB分析。
 

杆状病毒-昆虫细胞系统蛋白表达服务信息由深圳市拓普生物科技有限公司为您提供，如您想了解更多关于杆状病毒-昆虫细胞系统蛋白表达服务报价、型号、参数等信息，欢迎来电或留言咨询。

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