赛默飞Attune CytPix成像型流式细胞仪

创新点

• 声波聚焦zl技术，上样速度比传统流式细胞仪快10倍 • 高速明场成像功能，6000张图片/秒 • zl抗堵设计，大细胞、黏细胞轻松上样 • 可达4激光16个参数，配置灵活，可现场升级 • 具备细胞绝对计数功能，同时可配置流式自动化工作站

Invitrogen™ Attune™ CytPix™ 成像型流式细胞仪

Attune CytPix是在Attune NxT流式细胞仪的基础上增加了明场成像功能，既保留了传统流式高速、高参数、大数据分析的优势，又增加了明场观察细胞形态、活性等信息，在生命科学研究、细胞治疗和生物技术开发等领域都有广泛的应用前景。

其主要技术优势有：

·       声波聚焦技术，上样速度比传统流式细胞仪快10倍

·       高速成像功能，6000张图片/秒

·       zl抗堵设计，大细胞、黏细胞轻松上样

·       可达4激光16个参数，配置灵活，可现场升级

·       具备细胞绝对计数功能，同时可配置流式自动化工作站

高效、灵活、创新的成像流式细胞仪

Attune CytPix 成像型流式细胞仪是赛默飞推出的最新款流式细胞仪，不仅可通过声波聚焦液流系统实现高灵敏度、高通量流式检测，同时还可利用高速相机实现高通量图像采集。

特点

Attune CytPix 成像型流式细胞仪是一款先进的流式细胞仪，与 Attune NxT 流式细胞仪具有很多共同特点，比如声波聚焦液流系统、注射泵上样系统、绝对计数功能、可搭配自动化工作站以及免洗免裂解全血样本检测等。相比于Attune NxT，CytPix的独特之处在于搭载了高速明场相机，能够在单个细胞或颗粒通过流动室时同时记录其图像信息。高速相机和 Attune 软件搭配使用有助于确保所分析的事件是单细胞、而不是双联体、团块或碎片，这对于细胞和基因治疗相关的应用而言至关重要。CytPix可用于几乎所有流式实验，帮助研究人员了解每个细胞群的形态，以便进行深入免疫表型和功能分析。此外，这些图像信息还有助于识别碎片并优化实验方案。

工作原理

在 Attune CytPix 成像型流式细胞仪上采集样本时，高速相机可采集并存储多个事件的图像数据。高灵活性：Attune 流式细胞仪软件可根据需要调整图像采集频率，并可根据样本流速和图像大小，每秒可采集多达 6,000 张图像数据。声波聚焦技术可将待测细胞定位于鞘液流的中心位置，从而获得清晰的细胞图像。

声波聚焦技术使得细胞处于最佳成像位置

没有声波聚焦（左）时， 微球不能聚集在中心位置，图像经常模糊不清。声波聚焦（右）可减少横向位置变化、时间变化和景深限制，从而可获得清晰的细胞图像。

即使高通量采集也可以获得稳定的图像质量

声波聚焦和高速相机相结合后，无论进样速度如何，都可以得到 CAR-T 细胞的稳定成像结果，还根据实验需求轻松调节焦距和相机设置。

无论样品流速大小如何，都可以保持稳定的光学聚焦。即使是在最高1,000 μL/分钟的流速下也对细胞进行清晰成像，并可根据目的细胞类型调整焦距、成像窗和光源设置。

采集流式数据的同时记录细胞群图像数据，从而可以在散点图或直方图上直接选择图像数据并进行反向设门，这样就可以随时调整设门以确定圈定目的细胞，同时排除黏连体、非目的细胞和碎片。并且可利用内置细胞测量工具（含荧光和散射光信号）以设置和确认细胞群设门。

成像型流式细胞仪的应用领域

成像型流式细胞仪可用于任何想了解每个细胞群形态信息的研究。成像功能有助于进行更深入地结果分析，以便： 

实时确认圈门的准确性

基于图像结果调整圈门和相机设置，排除黏连细胞和碎片，以便更准确地进行设门

进一步对细胞群进行表征分析

在细胞凋亡检测等现有流式方案中同时记录细胞群的不同形态

捕捉细胞间的相互作用

提供清晰的图像数据

提供大细胞群的形态结构特征

可提供高通量、详细的图像验证

对细胞进行深入分析

基于荧光信号、散射光信号和形态学特征

高通量质量控制

在细胞培养的质控工作流程中加入快速成像结果，可以在高通量处理微孔板的同时监测细胞形态变化，从而快速检测细胞培养过程中的质量问题

图像辅助确认设门的准确性。图像结果辅助确认和调整圈门以包含单个目的细胞。例如，鸡红细胞核（chicken erythrocyte nuclei，以下简称 CEN）的细胞粘性较高，往往聚集成双联体或多个黏连体。研究人员通常使用碘化丙啶（PI）来分析黏连体，其中连续的峰对应为单个事件中包含的细胞数。成像结果显示，前峰的右侧就开始出现下一级黏连体。例如，第一个峰的右侧（理论上为单个细胞）却含有很多双联体细胞。缩小圈门范围可成功去除多余的黏连细胞，并将这些黏连细胞圈到下一级门内进行分析，这样的分析结果会更加准确。

对黏性较高的 CEN 细胞进行准确设门。

初始设门 (A) 包含多个双联体细胞。经过图像分析后，发现这些双联体细胞位于单细胞峰 (B) 的右侧。采用相同的方法调整每个峰的圈门，从而使得每个峰 (C) 中包含正确数量的细胞，通过改变设门策略使分析结果更准确。 

对细胞群进行表征分析。细胞形态等图像结果增加了流式细胞数据的丰度。例如，图例分析了用 Annexin V 和 PI染色 的常规凋亡结果，通过成像数据可同时获得各个细胞群的细胞形态特征。如果仅通过多色流式实验无法获取这种细胞形态变化的信息。

凋亡细胞的形态学特征。

用 10 µM 喜树碱 37ºC 培养 Jurkat 细胞 4 小时，以诱导细胞凋亡。样本用 Annexin V和 PI 进行染色后，在 Attune CytPix 成像型流式细胞仪上以 100 µL/分钟的流速进行数据采集。设门策略：流式散点图中单个细胞主要分为出三个细胞亚群。约 50% 活的凋亡细胞（Annexin V⁺PI^–，右下）出现气泡样的凋亡小体。约 25% 死的凋亡细胞（Annexin V⁺PI⁺，右上）显示出细胞表面颗粒度增大，且不完整细胞更多。约 10% 的健康细胞（Annexin V^–，左下）也会出现凋亡小体（尽管没有 Annexin V⁺ 细胞那样明显）。这些健康细胞也形态多样、并且尽管圈了单细胞门，但仍有一些双联体细胞出现。图中出现形态变化的细胞由黑色箭头标示。

“一张图片虽然没有1000个点，但确实通过图像信息有助于进行数据分析。很高兴能够同时看到染色的流式数据与图像结果。例如，Annexin V阳性细胞的形态与健康细胞不同，或者CD14⁺ 单核细胞比 CD3⁺/CD4⁺/CD14^- 淋巴细胞的体积更大、内容物更多。此外，还可通过图像查看单细胞门内含有多少黏连细胞，非常适合在分析中验证其是否为异常双阳性细胞。“

Kathryn Fox，

威斯康星大学麦迪逊医学公共卫生学院

分析细胞间相互作用。成像数据可以揭示细胞之间的相互作用。下图中，基因编辑过的 CAR-T 免疫细胞与 Ramos（淋巴瘤）细胞共培养后经染色，在 Attune CytPix 成像型流式细胞仪上进行数据采集和成像分析。第二象限的图像（双阳性，采集单个细胞）显示 CAR-T 细胞对Ramos 细胞有明显靶向杀伤作用，这是CAR-T 细胞发挥免疫效力的明确证据。

CAR-T 细胞对淋巴瘤细胞具有靶向杀伤功能的图像结果。

分别使用 CellTrace Far Red 和Violet 1:1标记 CAR-T 和 Ramos 细胞，在 37°C 下培养 1 小时。细胞浓度调整为>8 x 10⁵ /mL，在200 μL/min流速下使用Attune CytPix 成像型流式细胞仪采集未经过滤的样本。第一象限（中上）、第四象限（右下）和第三象限（左下）分别为单个 Ramos 细胞、CAR-T 细胞和碎片。第二象限的图像（双阳性，右上）结果显示存在细胞融合现象，反映 CAR-T 细胞对 Ramos 细胞具有吞噬功能。

揭示更多生物学现象

利用Attune CytPix 成像型流式细胞仪对细胞进行反向设门，基于图像结果可能发现更多感兴趣的细胞亚群，而传统流式数据无法提供这些形态学信息。

例如，大肠杆菌培养一段时间后可生成两种类型菌落形成单位（CFU），分别为与单细胞相似的短 CFU，以及带裂变环的不完整延长结构，代表每个近似细胞长度的不完全收缩。传统单个细胞门（SSC-A/SSC-H）和荧光信号门（SSC/核染色）均无法区分这些细胞群。但通过Attune CytPix 成像型流式细胞仪，可以对图像信息进行查看和分类，并根据其形态特征对不同 CFU 类型进行设门。

加长版的细菌CFU

鉴别两种大肠杆菌 CFU 类型。大肠杆菌在37ºC 条件下培养过夜，然后在 4ºC 条件下继续培养 3 天。使用 Attune CytPix 成像型流式细胞仪在 100 μL/min的流速下进行样本采集。可以从这些图像鉴别出两种 CFUs：(A) 单细胞短菌落和 (B) 带不完全裂变环的加长结构。各亚群细菌的典型图像如图所示，对所选图像进行反向设门证实两个细胞亚群在FSC/SSC点图中的流式结果（橙色点，左）并不相同。

监测细胞培养质控。成像数据可在细胞培养的早期有助于发现和追踪细胞培养的污染问题。例如，在某实验室中，在常规Ramos（淋巴瘤）细胞原代培养时发现，虽然可以看到细胞增殖现象，但细胞数量减少、细胞活力降低。进一步检测发现存在大量微生物污染，但这是从何时何处开始的？

由于该细胞系之前已经在Attune CytPix 成像型流式细胞仪上进行了分析，研究人员重新打开图像，发现至少五天前就记录了微生物感染。当时，污染早期的迹象被误认为碎片，但回顾性研究证实培养物中存在具有相同特征的问题细胞。追踪感染源有助于建立标准的实验室工作流程，以筛选和保护对实验具有关键性作用的细胞系。

调查 Ramos 细胞培养的污染问题。

常规检查Ramos（淋巴瘤）细胞原代培养时发现，虽然可以看到细胞增殖现象，但细胞数量减少、细胞活力降低。进一步研究发现存在微生物污染的情况，并通过 Attune CytPix 成像型流式细胞仪进行成像和反向设门得到了验证。这种污染的早期迹象最初被误认为是细胞碎片。