TissueFAXS Spectra多光谱定量分析系统

在显微成像领域，特别是免疫荧光样本成像中，当标记荧光素过多时，各个荧光素光谱发生重叠，采用传统滤光片成像，单个通道会采集到多个荧光信号，发生通道串色现象，无法获取纯净的单通道图像。TissueGnostics公司利用液晶可调谐滤光器将多光谱成像技术应用于显微成像，对样本进行多光谱成像，即λ-stack成像，巧妙解决了通道串色问题。

TissueFAXS SPECTRA PLUS
正置系统

TissueFAXS SPECTRA i PLUS
倒置系统

液晶可调谐滤光器成像元件（ Liquid Crystal Tunable Filters）：
可滤光光范围：420nm-730nm
步径精度：1nm

在相同条件下，每一个荧光素分子的发射光谱、不同波长位置的荧光强度比值都是固定的，这就为光谱拆分提供了理论基础。在明确所有标记荧光光谱的情况下，即可将其作为参照，进行运算得知多色标记样本中光信号分别是来源于哪一个荧光素及其所占比例，进而通过信号拆分得到每一个荧光纯净的图像数据。
光谱拆分技术解决了常规滤光片成像方式存在的通道串色问题，为多色标记成像提供了可能和准确的处理方法。

除此之外，免疫荧光实验中，自发荧光是非常常见的干扰，它不仅影响标记荧光强度准确定量，同时也会掩盖弱的荧光信号。而且同组织内自发荧光的物质来源是基本相同的，所以自发荧光可以等同看作一个“荧光素”。在获取其光谱后，同样可作为参照，将自发荧光从样本中拆解出来。

免疫组化实验中用到的苏木素、DAB等色素和荧光素类似，每个色素都具有特异性吸收光谱，也可使用光谱拆分的方式将多色标记组化样本进行拆分处理，提高明场免疫组化标记数目。


该图为荧光ECFP, EGFP和EYFP的独立和重叠光谱。取得每个荧光素和自发荧光的光谱之后，即可将它们导入StrataQuest Unmixing Engine作为参照进行多色标记样本信号拆分。

•利用多光谱成像技术对每个荧光素进行特定波长范围成像，即λ-stack成像，快速获取所有单标荧光样本参照光谱，同样空白样本自发荧光可等同视为一个“标记荧光”，获取其参照光谱。

•实现准确光谱拆分，每一个荧光、自发荧光的参考光谱都是必须的。

下图展示为TissueFAXS Spectra进行明场样本多光谱成像及处理工作流程。

通过λ stack成像获取多光谱数据后，利用光谱拆分技术拆解混杂信号，最终获得单标记通道图像。

光谱拆分算法明确了图像中采集到每一个像素的信号分别是来源于哪些荧光素和各荧光素所占比例。

明场与荧光多光谱显微成像主要应用在：

•免疫组化多色素标记样本成像、信号拆分。

•免疫荧光多色标记样本成像、信号拆分，同时可扣除自发荧光。

•多光谱系统不仅支持多标记染色成像和信号拆分，又可以提供更精准的信号强度及形态学结果。