生物制药N端测序

Edman降解（埃德曼降解）法，是由菲尔•埃德曼（Pehr Edman）首先创立用于肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析的方法。Edman降解法检测的原理非常简单，在碱性条件下反应，用异硫氰酸苯酯（Phenylisothiocyanate, PITC）与待检测的蛋白质（多肽）的N-端氨基生成苯氨基硫甲酰（PTC）的衍生物，然后处理-关环-选择性切断肽链N-端，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂萃取衍生物，在酸的作用下，不稳定的衍生物转变为稳定的的乙内苯酰硫脲（PTH）衍生物，余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），可以鉴定出氨基酸类别。重复氨基酸鉴定反应可以达到对N端氨基酸按照从N端到C端的方向依次对氨基酸序列进行分析。对于序列较长的蛋白质（多肽），还可以将样品先切成小的肽段，先对肽段序列分析，再将肽段信息进行拼接即可获得完整蛋白质的序列信息。

蛋白质N端测序流程

Edman降解法用于N端测序的优点：

1. PITC与所有氨基酸残基的反应产率和回收率高，因此副产物少，可通过色谱进行准确鉴定；
2. 反应时间快，对于大多数氨基酸残基来说，30min耦合时间，5min切割反应时间即可；
3. 反应后的肽链仍然是完整的，可用Edman降解法重复测定新生的N末端氨基酸。

Edman降解法用于N端测序需要注意的问题：

1. 样品纯度需 >90%, 盐离子含量在50mmol/L之内，不含SDS等变性剂，N端必须是均一的高纯样品；
2. 10Pmol 样品可以测定20 aa；
3. 液体样品不能含有蛋白酶，建议尽早测试，防止时间太长容易降解；
4. 转膜样品在转膜前不宜放置太久以防样品扩散，转膜后可密封保存3-6个月, 建议使用Coomassie R-250进行染色，电泳缓存液建议使用CAPS buffer；
5. 样品无信号峰是，建议蛋白进行N-端封闭；
6. 建议整个反应过程中尽可能使用高纯buffer。

案例分析：

百泰派克生物科技采用岛津公司推出的PPSQ系列仪器实现对蛋白或者多肽样品N端氨基酸序列的分析，可以分析N端30个以上的氨基酸。以下是我们对某一蛋白药物进行分析的实际色谱结果，该项目对样品中蛋白药物的前15个氨基酸进行了分析。从下图（第15个氨基酸的色谱图）可以看出，色谱峰值仍然非常高，可以得到非常准确的结果。

中/英文项目报告

在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：

1. 实验步骤（中英文）
2. 相关的质谱参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 生物药物N端序列信息

生物药物N端序列测定一站式服务

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