尼康N-STORM 超分辨率显微镜系统

概述/主要特征

十倍提升X,Y,Z方向的分辨率

随机光学重构显微镜（STORM）通过整合荧光样本中单个荧光团的精确定位信息来重建超分辨荧光图像。N-STORM 利用尼康强大的Ti2-E倒置显微镜的优势，在三维方向（XYZ)上应用高精确度的多色定位和重建技术，使成像分辨率达到传统光学显微镜的十倍（xy方向约20nm）。

这种强大的技术可以用于观察纳米水平分子间的相互作用，开辟了科学认知的新世界。

主要特性

轴向分辨提高10倍，可达50nm

相比于传统显微镜，除了横向超分辨的提高，N-STORM采用特有的技术使轴向分辨率增加了近十倍，并提供样本的纳米水平3D信息。

3D-Stack功能支持拍摄不同Z位置的多个3D STORM成像，并将其拼接成一个图像，以创建更厚的STORM图像。

横向分辨率提高10倍，可达20nm

N-STORM利用视野中存在的上千个单个荧光团的高精度定位信息来创建令人惊叹的“超分辨”图像，其空间分辨力是传统光学显微镜的10倍。

用Alexa Fluor®647（NUP153）和ATTO 488（TPR）标记的人宫颈癌细胞（HeLa S3）

图像来源：佛罗里达州立大学国家高磁场实验室的Michael W. Davidson博士

动态超分辨率成像

新开发的光学和照明系统针对sCMOS技术进行了优化，图像采集速度提高了10倍。随着采集时间从几分钟减少到几秒*，可以捕获活体样本的动态事件，且达到分子水平分辨率。

*使用高速模式（20μmx20μm成像区域）

多色成像功能

多色超分辨成像的实现有两种方式：基于活化基团/报告基团染料对的顺序激活成像和无需活化基团标记的连续激活成像。这种灵活性使用户可以轻松捕获分子水平上多种蛋白质的定位和相互作用特性，得到关键见解。

CV-1细胞三色STORM成像：α-微管 (Alexa Fluor® 647,紫色), 窝蛋白 (Alexa Fluor® 555,红色), 肌动蛋白（ Alexa Fluor® 488-phalloidin ,绿色 )

高清晰度、高密度图像

新开发的激发光学部件和改进的图像采集速度增加了分子定位密度，从而获得更清晰的大分子结构图像。

 

左：改进后的图像质量； 右：改进前

标尺： 5µm

在同等的时间内，超分辨图像质量得到的明显的提升。

样品：Alexa Fluor® 647标记的BSC-1细胞微管； 拍摄时间： 20s

大视野图像采集

新开发的成像系统中的中间变倍透镜对大视野成像进行了优化。宽视图模式可实现80μmx80μm的图像采集，比之前的成像面积增加了4倍。

在多尺度实验的成像模式之间无缝切换

N-STORM可以与诸如A1+的共聚焦显微镜同时组合使用。用户可以在低放大率/大视野的共聚焦图像中指定样本中的期望位置，并通过简单地切换成像方式获得超分辨图像。将共聚焦显微镜与超分辨系统组合，可以为获取的超分辨图像提供整体样品的背景信息。

可量身定制的硬件配置

可选择全自动或简单的电动化TIRF照明器、最新的sCMOS相机或久经考验的EMCCD相机。拥有尼康系统的模块化设计，可为单分子成像及其他需求量身定制灵活稳定的平台。

N-STORM专属物镜

硅油物镜

硅油物镜使用高粘度硅油作为浸没液体，其折射率接近活细胞的折射率。由于这种改进的折射率兼容性，当在样品中深处进行超分辨率成像时，这些物镜提高光子收集能力和分辨率。它们在宽波长范围内表现出优异的色差校正和高透射率。

深度约6.5μm，左：CFI SR HP Plan Apochromat Lambda S 100XC Sil，右：CFI SR HP Apochromat TIRF 100XC Oil

油浸物镜

这些物镜提供了N-STORM成像所需的高数值孔径。HP物镜与诱导荧光基团快速光开关所需的超高功率激光器兼容。它们提供改进的轴向色差校正，保证3D 多色STORM成像精确的定位和图像对准。配备着在Ti2-E显微镜的带自动校正环AC型物镜，可以对校正环进行精确、轻松的调整。

原理

结构化照明显微镜的原理

随机光学重建显微术（STORM）通过整合单个荧光团在三维和多色成像上的高精度定位来重建超分辨率图像。

N-STORM使用非常低强度的光来随机激活相对少量的荧光基团。荧光基团的这种随机 “激活”支持单个分子的时间分离，使得能够在XY中对每个荧光基团图像进行高精度高斯拟合。通过使用特殊的3D-STORM光学系统，N-STORM还可以高精度地沿Z轴定位各个分子。结合三维的分子坐标，用户可以得到超分辨率的3D图像。

高精度Z轴位置检测

使用在X或Y方向上不对称地聚光光束的柱面透镜，用户能以约50nm的精度定位Z轴分子位置。通过检测在X或Y方向上的像散引起的拉伸的方向和非焦面图像的尺寸来确定Z轴的位置。将确定的Z轴位置信息与XY轴位置信息整合，即可重建3D荧光图像。

满足高精度定位的各类光控探针和标记方式

多种活化基团-报告基团染料对以及不含活化基团的标记方式均可使用。活化基团-报告基团染料对的方式是通过在不同通道之间使用相同的报告染料，以确保得到一致的定位精度。每个染料对由活化染料和报告染料组成。活化染料调节报告染料的激活状态。

不含活化基团的标记仅由成像染料组成，只需简单的样本标记和制备技术即可，例如使用常规染料藕联抗体的传统间接免疫荧光法。

尼康新代N-STORM 超分辨显微成像系统简介：

    与N-STORM相比，N-STORM 4.0的图像采集速度提高了10倍，使得活细胞纳米级分辨率图像的拍摄成为了可能。2015年3月15日，N-STORM 4.0在德国哥廷根的“聚焦显微镜”会议上次亮相，并于3月底正式上市。
    自从2010 年N-STORM发布以来，尼康在超分辨显微镜领域直处于地位。N-STORM基于由哈佛大学霍华德休斯医学研究所庄小威博士开发的随机光学重构显微技术，其原理是通过荧光分子的闪烁，暂时分离出单个的荧光分子并对其进行精确定位，从而重构出纳米级分辨率的图像（分辨率是传统光学显微镜的10倍）。N-STORM 4.0作为N-STORM 的升级产品，实现了活细胞动态过程的超分辨成像。
  2014年的诺贝尔化学奖授予了超分辨显微镜领域，这证明超分辨显微镜技术正得到越来越多的关注，与此同时，超分辨技术应用扩展的需求也在增加。新的研究表明，基于随机光学重构的超分辨技术实现了活细胞动态超分辨成像，前所未有的观察到了细胞内结构的纳米级动力学过程，如黏着斑1，网格蛋白小窝中的转铁蛋白簇2，线粒体和内质网等细胞器3。
  N-STORM 4.0 实现了激光激发设计和sCMOS相机的升级，单张图像的采集速率从分钟级提高到秒。另外，新系统在成像视野的选择上提供了更高的灵活性，用户可以选择活细胞高速成像模式，或者选择固定细胞的大视野成像模式，以适应不同的应用需求。

1 Shroff, H. et al., 2008, Nature Methods, 5 (5), p417-423.
2 Jones, S.A. et al., 2011, Nature Methods, 8 (6), p499-505.
3 Shim, S-H. et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci., 109, p13978-13983. 

主要特点

1、纳米级水平的动态超分辨成像

    新升级的光学和照明系统，完美匹配sCMOS相机。
    图像采集速度比N-STORM提升近10倍，单张图像拍摄时间从分钟级提高到秒级。
    活细胞动态超分辨成像，分辨率比传统光学显微镜提高10倍。

80umX80um（拍摄分辨率512X512），拍摄速度30Hz；

40umX40um（拍摄分辨率256X256），拍摄速度100Hz；

20umX20um(拍摄分辨率128X128)，拍摄速度500Hz。

2、高质量的超分辨成像 

     新升级的照明放大镜提高了激光的激发效率，使得单位面积的荧光分子密度增加。
     采集足够数量荧光分子所需时间更短，图像采集速度显著提高。
     单位时间内采集到的荧光分子数更多，图像清晰度显著提高。

(Left) Microtubules labeled with Alexa Fluor® 647* imaged with N-STORM 4.0 (with a 20 second acquisition time)
(Right) Same specimen imaged with conventional N-STORM system (with a 20 second acquisition time)
*Alexa Fluor is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific, Inc.

3、宽视野的超高分辨率成像

    新开发了成像系统中间变倍体，实现更大视野拍摄。
   80μm x 80μm大视野成像，成像区域是前代N-STORM的4倍。

Left: 4 times wider imaging area, 80 μm x 80 μm (wide-view mode)
Right: Imaging area of conventional model, 40 μm x 40 μm
Sample: Mitochondria TOM20 conjugated with Alexa647

4、多重漂移矫正机制

    1）自相关漂移矫正算法，可矫正XYZ三维方向上的位置漂移。

    2）以荧光小球或其他发光颗粒进行定位标记参照，进行三维方向上的漂移矫正。

5、N-STORM成像物镜

    HP (High Power) 物镜与高功率激光相匹配，使荧光基团发生快速闪烁。
    改进轴向色差校正，提高多色荧光的3D成像精度。                                                                   

超分辨率荧光显微镜技术大大的超出了传统光学显微镜的分辨率限

    N-STORM是种超分辨率数字显微镜系统的新技术，该技术将“随机光学重构显微术”（哈弗大学授权）与尼康的Eclipse Ti研究级倒置显微镜结合在了起。N-STORM能够显著提高分辨率可达到传统光学显微镜分辨率的十倍或者更多，N-STORM可采集纳米级的二维或三维多光谱图像，横向分辨率接近20nm轴向分辨率也接近50nm。N-STORM将光学显微镜的分辨能力延伸到了前所未有的分子水平。

远大于传统光学显微镜的分辨率
与传统荧光显微镜不同，STORM并没有在同时间观察样品中所有的荧光标记分子，在某时间点她只是激活其中的小部分。重复这过程可获得多张图像，在这些图像中分子以纳米的精度定位，组合这些图像将终重构出超级的分辨率。
 通过重叠单分子图像构建超分辨率的影像

“STORM”这新技术是通过多次曝光进而运算得到荧光团的高精度定位信息，通过整合这些信息而重构出高分辨率的荧光图像（2D或3D）。这技术可获得更多丰富的细节信息，并更进步使对样品的理解从结构水平进化到分子水平。 

以超高的分辨率获取三维信息

“STORM”技术通过多次曝光可运算得到荧光团高精度的Z轴定位信息，对这些信息进行重构即可获得纳米级分辨率的荧光3D图像。正如单个分子可在x-y的维度中被定位样，N-STORM的3D组件同样可在Z轴中确定单个分子的位置从而获得高精度的3D超分辨率图像。

独特的多色彩技术
采用不同有机染料的混合物可以实现多色彩的成像。这些染料是种独特的可以通过短波长激光活化而发光的荧光探针，通过不同波长的激光激发而成为彩色图像：起始时这类探针处于非活化的状态，随后他们由特殊波长的激发光激发而产生荧光。这过程可使各个荧光团分别发光，从而相互区分开来，进而多次捕获的图像可以经过编辑成为终具有超高分辨率的图像。

简单，灵活的配置
尼康已有的标准硬件配置让N-STORM能大程度的使用户获益。这也意味着超分辨率的能力可以添加到领导市场的尼康Ti-E倒置显微镜上面或者是新出品的A1R共聚焦显微镜系统上面使用，N-STORM可轻易的配合已有产品搭建多功能的系统。

2015年3月15日，N-STORM 4.0在德国哥廷根的“聚焦显微镜”会议上次亮相，并于3月底正式上市。
    自从2010 年N-STORM发布以来，尼康在超分辨显微镜领域直处于地位。N-STORM基于由哈佛大学霍华德休斯医学研究所庄小威博士开发的随机光学重构显微技术，其原理是通过荧光分子的闪烁，暂时分离出单个的荧光分子并对其进行精确定位，从而重构出纳米级分辨率的图像（分辨率是传统光学显微镜的10倍）。N-STORM 4.0作为N-STORM 的升级产品，实现了活细胞动态过程的超分辨成像。