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百科知识

  激光扫描共聚焦荧光显微镜/激光扫描共聚焦显微镜

  中文名 激光扫描共聚焦荧光显微镜

  半导体激光器 405nm(近紫外谱线)

  扫描模块 针孔光栏等

  基本结构 激光光源、荧光显微镜等


  简介

  激光扫描共聚焦荧光显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、目前最先进的分子细胞生物学的分析仪器。主要用于观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化,定量分析,以及实时定量测定等。


  历史

  ·1957年,Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理,获得了美国的专利。

  ·1967年,Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。

  ·1977年,Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。

  ·1984年,Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜,型号为SOM-100,扫描方式为台阶式扫描。

  ·1986年MRC-500型改进为光束扫描,用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。

  ·1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文,标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。

  ·随后Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜,产品的性能不断改进和更新,应用的范围也越来越广。


  共聚焦扫描显微镜的成像原理

  采用点光源照射标本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点,该点被照射后发出的荧光被物镜收集,并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔,分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致,约100-200nm;相对于焦平面上的光点,两者是共轭的,即光点通过一系列的透镜,最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样,来自焦平面的光,可以会聚在探测孔范围之内,而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品,探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像,转为数字信号传输至计算机,最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

  每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面,这个光学横切面总是有一定厚度的,又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强,而且非焦平面光被针孔滤去,因此共聚焦系统的景深近似为零,沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描,形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面(焦平面)扫描与Z轴(光轴)扫描相结合,通过累加连续层次的二维图像,经过专门的计算机软件处理,可以获得样品的三维图像。

  即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点,使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

  激光共聚焦的工作原理简单表达就是它采用激光为光源,在传统荧光显微镜成像的基础上,附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置,通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。

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  激光扫描共聚焦显微镜基本结构

  激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

  (1)扫描模块

  扫描模块主要由针孔光栏(控制光学切片的厚度)、分光镜(按波长改变光线传播方向)、发射荧光分色器(选择一定波长范围的光进行检测)、检测器(光电倍增管)组成。荧光样品中的混合荧光进入扫描器,经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后,被分成各单色荧光,分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象,同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。

  (2)荧光显微镜系统

  显微镜是LSCM的主要组件,它关系到系统的成像质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜,有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换,滤色片组的选取,载物台的移动调节,焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。

  激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同,但又有其特点:需与扫描器连接,使激光能进入显微镜物镜照射样品,并使样品发射的荧光到达检测器;需有光路转换装置,即汞灯与激光转换,同时汞灯光线强度可调。

  (3)常用激光器

  激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统,常用的激光器包括以下三种类型:

  半导体激光器:405nm(近紫外谱线)

  氩离子激光器:457nm、477nm、488nm、514nm(蓝绿光)

  氦氖激光器:543nm(绿光-氦氖绿激光器)633nm (红光—氦氖红激光器)

  UV激光器(紫外激光器):351 nm、364 nm(紫外光)

  (4)辅助设备

  风冷、水冷冷却系统及稳压电源。

  激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的一定波长的激发光,光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源,由物镜聚焦于样品的焦平面上,样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光,通过检测孔光栏后,到达检测器,并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成了一幅完整的共焦图像,称为光切片。


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  激光扫描共聚焦荧光显微镜相对普通荧光显微镜的优点

(1)LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的,所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理;

(2)LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰,提高了分辨率,显著改善了视野的广度和深度,使无损伤的光学切片成为可能,达到了三维空间定位;

(3)由于LSCM能随时采集和记录检测信号,为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径;

(4)LSCM除具有成像功能外,还有图象处理功能和细胞生物学功能,前者包括光学切片、三维图象重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定;后者包括黏附细胞的分选、激光细胞纤维外科及光陷阱技术、荧光漂白后恢复技术等。


  激光扫描共聚焦荧光显微镜的缺点

  标记染料的光漂白:为了获得足够的信噪比必须提高激光的强度;而高强度的激光会使染料在连续扫描过程中迅速褪色。

  光毒作用:在激光照射下,许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素。限制扫描时间、激发光强度,以保持样品的活性。


  样品要求

  1. 样品经荧光探针标记;

  2. 固定的或活的组织;

  3. 固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上;

  4. 悬浮细胞,甩片或滴片后,用盖玻片封片;

  5. 载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,盖玻片应光洁,厚度在0.17mm左右

  6. 标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不能充分激发;

  7. 尽量去除非特异性荧光信号;

  8. 封片剂多用甘油:PBS混合液(9:1)

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