蛋白表达技术全攻略

1.启动子

启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列.没有启动子,基因 就不能转录.由于细菌 RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子.

原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸 序列组成,对mRNA的合成极为重要.在转录起始点上游5～10 bp处,有一段由6～8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区.来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化.在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区.转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子.-35区与RNA聚合酶 s 亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA 聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链.

原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、l PL (l 噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等.

(1)Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因 (O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成.Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控.正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子,促使转录 进行.负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录.乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与O基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生.

(2)trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子,其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性.当缺乏色氨酸时,该启动子开始转录.当色氨酸较丰富时,则停止转录.b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合,解除阻遏蛋白的活性,促使trp启动子转录.

(3)Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强.其中Tac 1是由Trp启动子的-35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成,Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区,加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成.Tac启动子受IPTG的诱导.

(4)l PL 启动子：它来自 l 噬菌体早期左向转录启动子,是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子.l PL 启动子受控于温度敏感的阻遏物cIts857.在低温(30 ℃ )时,cIts857阻遏蛋白可阻遏PL 启动子转录.在高温(45 ℃ )时,cIts857蛋白失活,阻遏解除,促使PL 启动子转录.系统由于受cIts857作用,尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物,缺点是温度转换不仅可诱导PL 启动子,也可诱导热休克基因,其中有一些热休克基因编码蛋白酶.如果用 l 噬菌体cI+ 溶源菌,并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导,可缓解这一矛盾.

(5)T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子,具有高度的特异性,只有T7RNA聚合酶才能使其启动,故可以使克隆化基因独自得到表达.T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右,它能使质粒沿模板连续转录几周,许多外源终止子都不能有效地终止它的序列,因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列.这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因.但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶.应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶,它可以由感染的 l 噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生;第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体.

2.SD序列

1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列.这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3 ¢ 末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点.以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列.它与起始密码子AUG 之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译.另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后,才能产生一个完整的蛋白质.

3.终止子

在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子 (terminator).转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来.对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点,即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C富含区域又具有回文对称结构.这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构,并且有与A/T富含区对应的一串U.转录终止的机制较为复杂,并且结论尚不统一.但在构建表达载体时,为了稳定载体系统,防止克隆 的外源基因表达干扰载体的稳定性,一般都在多克隆 位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子.