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一、实验目的

1.熟悉亲和层析 纯化蛋白质的的原理。

2.初步掌握亲和层析法纯化胰蛋白酶的方法步骤。

二、实验原理

亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原 、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等，也可用于分离细胞、细胞器、病毒等。近十多年来，亲和层析发展十分迅速，尤其是对那些分离流程长、难度大、浓度低、杂质多，采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲和层析显示出其独特的优越性。

亲和层析主要是根据生物分子 与特定的固相化配基之间的亲和力而使生物分子得到分离。它是由吸附层析衍生、发展起来的分离技术。利用亲和层析载体固相化配基与亲和互补物之间通过范德华力、疏水力、静电力、氢键作用等发生专一性的结合而进行分离。这种有选择性地结合主要归结于固相化配基与亲和互补物二者之间的生物学特性和特异的化学结构以及空间构象。在亲和层析过程中，被纯化的生物分子在一定的条件下，选择性地结合到被共价偶联到不溶性载体上的配基上，然后改变原有的条件，如洗脱液的PH 值、离子强度、有机溶剂的浓度等，有选择性地从载体上把被分离物洗脱下来。通过亲和层析法分离的物质，其纯度、活性回收率及纯化倍数均较高。

亲和层析的载体要选用机械强度高、非特异性吸附少、水不溶性的、具有较多化学反应基团—羟基的多糖类介质，该载体在温和条件下与配基共价偶联，而又不影响配基及被分离物质原有的生物学特性。

1967年Porath 和Ernback 报道了采用溴化氰可将含有氨基的有机分子偶联到多糖基上，使得亲和层析技术向前推进了一大步。直到目前，溴化氰活化载体还是用得最多，效果最好的活化方法。1971年Porath 又报道了应用环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体的方法，克服溴化氰由于剧毒给操作带来的不便，使活化载体的方法简便易行，亲和层析技术得到广泛的应用。

目前可用于活化载体的活化剂有几十种之多，但常用的是溴化氰、环氧氯丙烷、1.4—丁二醚、戌二醛等。采用环氧氯丙烷为活化剂，sepharose 4B 为载体，鸡卵类粘蛋白为配基可合成适用于分离胰蛋白酶的亲和吸附

剂。载体活化及偶联反应如下：

1. 环氧氯丙烷活化载体与配基偶联

2. 溴化氰活化载体与配基偶联

上述反应，除了氨基能偶联外，也能与巯基发生偶联反应。

另一种与配基的偶联方式是插入”手臂”。在亲和层析中如果要以一个小分子作为配基(如胺类)，而被分离物(亲相互补物)又是一个大分子，二者在结合过程中就会受到空间阻碍，影响结合效果。因此，必须在载体和配基之间引入一段”手臂”，即再接上一段有机分子，使载体上的配基向外扩展伸长以增强配基和互补物之间的接触面，减少空间位阻，提高亲和层析的结合效率。合成过程要经过载体活化，接” 臀”、活化及连接配基等操作步骤。

目前常用的载体是琼脂糖胶粒。它具有机械强度高、透性好、载体本身非特异性吸附少等优点。除此以外，其他可用作载体的材料还有纤维素、葡聚糖凝胶(SePhadex)、多孔硅胶、树脂等。但是它们都具有不同程度的非特异性吸附，因此目前使用的并不多。

本实验采用猪胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵类粘蛋白作为配基.从猪胰脏的粗提液中分离纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胶蛋白酶有很强的抑制作用。而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用。在pH7.6~8.0的范围内，猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵类粘蛋白上，在 PH2.5~3.0的范围内，能从鸡卵类粘蛋白上被洗脱下来。因此，采用鸡卵类粘蛋白作为配基合成亲和吸附剂，可以从猪胰脏的粗提液中，通过亲和层析直接获得纯度很高的猪胰蛋白酶。比活力可以达1.5~2.0×104BAEE 单位/mg 酶蛋白，相当5次重结晶的胰蛋白酶，纯化效率可提高10-20倍以上。

三、仪器、原料和试剂

器材：

紫外分光光度计、核酸蛋白质检测仪、高速组织捣碎机、恒温水浴摇床、L 层析柱(10mm×100mm)、G—3玻璃烧结漏斗、酸度计、抽滤瓶。

原料

新鲜猪胰脏

试剂

1. 环氧氯丙烷，1，4—二氧六环，乙烯，乙腈，溴化氰

2. 5mol/L 硫酸;

3. 5.0mol/L 氢氯化钠

4. 0.2mol/LpH9.5碳酸钠缓冲液。

5. 亲和柱平衡液：0.5mol/L 氯化钾—0.05mol/L 氯化钙-0.1mol/L，pH7.8 tris-HCl 缓冲液;

6. 亲和柱洗脱液：0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液;

7. pH2.5~3.0乙酸酸化水。

8. Sepharose 4B ，鸡卵类枯蛋白，纯胰蛋白酶。

四、操作步骤

(一) 载体—SePharose4B 的活化

1.环氧氯丙烷活化法：

取适量的sepharose 4B，于G—3玻璃烧结漏斗(简称G—3漏斗)上抽去保护液。称10g(湿重)Sepharose 4B，用100mL0.5mol/L 氯化钠溶液淋洗，除去56Pha rose 4S 凝胶内的保护剂，用蒸馏水洗净，转移到100mL 的锥形瓶内。然后加入6.5mL 2.0moL/L 氢氧比钠溶液、1.5mL 环氧氯丙烷、15mL 56%1，4二氧六环，于45℃的恒温水浴摇床内振荡活化2小时。然后将活化的凝胶转移到G3漏斗内抽干，用蒸馏水洗至pH8.0左右，再用20mL 0.1mol/L，pH9.5碳酸钠缓冲液淋洗。处理完毕后立即偶联。

2.溴化氰活化法：

称取10g Sepharose 4B(湿重)，凝胶处理方法与1相同，把SePharose 4B 凝胶转移到一个100mL 的烧杯中(以下操作步骤必须在通风橱内进行)。加入15mL 0.2mol/LpH10.0的碳酸钠缓冲液，然后将烧杯放置冰浴中，用电磁搅拌器慢慢搅拌。戴上胶皮手套，小心称取3g 溴化氰，加入3mL 乙腈将溴化氰溶解。

取一支滴管向烧杯内滴加溴化氰使它与Sepharose 4B 反应，同时取另一支滴管向烧杯内滴加6mol/L 的氢氧化钠.使反应体系的pH 值保持在pH10.0左右(在酸度计上校正)，待溴化氰加完以后继续搅拌，反应5分钟。此时反应体系的pH 值不再下降，仍维持在pH10.0左右，停止反应。迅速转移到G3漏斗内抽滤，抽滤瓶内应预先加入一定量的固体硫酸亚铁，以破坏滤液中未反应的溴化氰。用 200mL 预冷的蒸馏水淋洗，最后浸泡在20mL 0.1mol/LpH9.5，碳酸钠缓冲液中，处理完成后立即偶联。

3.配基—鸡卵类粘蛋白的偶联：

将已经活化处理好的Sepharose 4B 转移到一个50mL 的锥形瓶内。然后取I0mL0.1mol/L，pH 9.5的碳酸钠缓冲液将约150mg 的鸡卵类粘蛋白溶解，取出0.1mL 蛋白溶液稀释30倍，在紫外分光光度仪上测定A280。根据消光系数A=4.13计算出偶联前的蛋白含量。再将9.9mL 蛋白溶液加入到盛有活化Sepharose 4B 的三角瓶内，混匀，在40-45℃的恒温水浴摇床内振荡偶联20-24小时左右，终止偶联。

将凝胶转移到G3漏斗内，用100mL 0.5mol/L 的氯化钠溶液抽浊、淋洗，以除去未被偶联的鸡卵类粘蛋白。取一个干净的抽滤瓶收集滤波，测定滤液A280，计算出末被偶联蛋白的量，然后用100mL的蒸馏水洗，用50mL 0.1mol/L 甲酸-0.5mol/L 氯化钾，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸馏水洗至约pH6.5即可。将凝胶转移至50mL小烧杯内，用30mL 0.5mol/L氯化钾—0.05mol/L氯化钙0.1mol/L、pH7.8Tris—HCL 缓冲液浸泡20分钟。脱气后装柱或置4℃冰箱保存。

(二) 胰蛋白酶粗操液的制备

取50g 猪新鲜胰脏(除去脂肪和结缔组织)剪碎置于高速组织捣碎机内，加入200mL预冷的pH2.5~3.0的乙酸酸化水，匀浆。于10℃提取4小时以上，4层纱布过滤，收集滤液并用5mol/L 的氢氧化钠调至PH8.0，加入终浓度为0.1mol/L 氯化钙及1~2mg 胰蛋白酶晶种，置4℃激活12~16小时或在室温(25℃左右)激活2~4小时。待胰蛋白酪比活达到1000~1500 BAEE 单位/mg 以后，用6mol/L 硫酸调至pH3.0停止激活。

放置4℃冰箱内备用。测定胰蛋白酶活性。

(三)亲和层析纯化胰蛋白酶

取一支层析柱(10mm×100mm)，装入少量亲和柱平衡液(0.5mol/L 氯化钾—0.05mol/L 氯化钙0.1mol/L，pH7.8 Tris—HCl 缓冲液)，将亲和吸附剂一次装入柱内，待亲和吸附剂自然沉降至约1/2总体积后，调节合适的流速。用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液.待基线达到稳定后即可。

取一定体积的蛋白酶粗提液(30-50mL，视酶液的蛋白浓度及比活而定)调至pH8.0.用滤纸过滤，取滤液上柱吸附，然后用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液，待基线达到稳定后改用亲和柱洗脱液(0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液)洗脱。收集洗脱峰2，测定酶蛋白含量及活性，

层析图谱，如图3—9。

图3—9 亲和层析纯化胰蛋白酶洗脱曲线

平衡液：0.5mol/L 氯化钾，0.05mol/L 氯化钙，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 缓冲液。

洗脱液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化钾，pH2.5混合液。

(四) 胰蛋白酶的保存

经亲和层析分离得到的胰蛋白酶，一般是比较纯的酶，但是酶蛋白的浓度往往很低。通常可用pH5.0的乙酸透析除去溶液中的无机盐，然后冰冻干燥成粉末，长期保存。也可将酶溶液放在-20℃的冰箱冰冻保存或者在4℃，pH3.0的酸性溶液中保存，可保存两年左右。

(五)结果处理