一、Ligases

Q-1: 各种连接酶特性的比较。

T4 DNA Ligase

Q-2: 与分子内连接反应相比，容易发生分子间连接反应的DNA浓度为多少?

Q-3: 平滑末端及突出末端的连接效率的差别。

Q-4: 在10%聚乙二醇存在的条件下，可以进行转化吗?

Q-5: 要想让DNA环化，盐浓度 (NaCl、KCl等) 多少为好?

A-6: 连接液是否需要乙醇沉淀纯化之后再转化?

Q-7: T4 DNA Ligase与DNA Ligation Kit Ver.2.0 (TaKaRa Code：D6022) 的区别。

T4 RNA Ligase

Q-9: T4 RNA Ligase的应用。

Q-10: 使用T4 RNA Ligase要注意哪些问题？

Q-11: 使用T4 RNA Ligase如何终止反应？

二、Alkaline Phosphatases

Q-1: 虾来源的酶 (SAP)、大肠杆菌来源的酶 (BAP)、小牛肠来源的酶 (CIAP)特性比较。

Q-2: BAP、CIAP和SAP的区别。

Q-3: SAP降解PCR反应后残存dNTP的反应体系。

Q-4: 如何提高Alkaline Phosphatases去磷酸化的效率?

Q-5: 限制酶处理后，不经过Buffer更换可以直接使用CIAP吗?

Q-6: CIAP对金属离子的要求如何?

Q-7: 5’末端结构不同，反应条件有何不同?

Q-8: 载体去磷酸化反应后，如何检测?

三、DNA Polymerase

DNA Polymerase

Q-1: 各种DNA Polymerase的特性比较。

Q-2: Klenow Fragment的补平反应体系及反应条件。

Q-3: Klenow和T4 DNA Polymerase有何差别？

Q-4: Klenow用于DNA末端的修复后，连接效率并不好，为什么？

Q-5: 想在16～22℃使用Klenow，此时的相对活性是什么？

Q-6: Klenow用于DNA修复时，DNA好像少量被分解了，为什么？

Q-7: 为什么用Klenow和ddNTP进行末端标记的效率不理想？

Q-8: 想用T4 DNA Polymerase将3’ 突出末端切成平末端时，dNTP必须吗？

Q-9: 超声波处理后产生的3′凹陷末端具有磷酸基的DNA片段能用T4 DNA Polymerase修复 吗?

反转录酶

Q-10: 各Reverse Transcriptase的区别。

Q-11: 合成不了长链cDNA的原因是什么？

TDT

Q-12: 使用TdT酶要注意哪些问题？

四、RNA Polymerase

Q-1: 使用RNA Polymerase要注意哪些问题？

Q-2: 反应结束后，是否需要做DNase I (RNase free)处理？

五、Nuclease

Q-1: 各种Nuclease的特性比较。

Q-2: 各种核酸酶的使用注意事项。

Q-3: 末端平滑时S1 Nuclease与Mung Bean Nuclease的区别。

Q-4: Mung Bean Nuclease作用后DNA电泳条带模糊，是切入 (Nibbing)了吗?

Q-5: 在BAL 31 Nuclease的反应液中，加入了600 mM的高浓度NaCl，对反应有没有影响?

Q-6: BAL 31 Nuclease也对Nick作用吗?

Q-7: 只想从末端除去几个核苷酸时，用通常的反应条件切过了怎么办?

Q-8: Exo III作用于DNA后进行Agarose电泳时，出现电泳带模糊，是非特异性的Nuclease污染吗?

Q-9: DNase I (RNase Free)的使用注意事项。

六、DNA Topoisomerase I，T4 Polynucleotide Kinase，Ribonuclease Inhibitor

Q-1: 使用DNA Topoisomerase I要注意哪些问题？

Q-2: T4 Polynucleotide Kinase催化5’ 末端标记反应的效率如何？

Q-3: T4 Polynucleotide Kinase的失活方法。

Q-4: 使用T4 PNK标记DNA时，能用〔γ-35S〕代替〔γ-35P〕ATP吗？

Q-5: 使用Ribonuclease Inhibitor要注意哪些问题？ 一、Ligases

Q-1: 各种连接酶特性的比较。

A-1:

↑TOP T4 DNA Ligase

Q-2: 与分子内连接反应相比，容易发生分子间连接反应的DNA浓度为多少？ A-2: 与DNA分子大小有关，DNA浓度越稀越容易发生分子内连接反应。从理论上讲，计算式：51.1/ (DNA浓度：g/l)÷ (分子量：dalton)0.5的值如果小于1就容易发生分子间的连接反应，大于2则易发生分子内的连接反应。

例： 对于λDNA (48,502 bp)： 浓度大于1 μg/100 μl时，容易发生分子间连接；浓度小于1 μg/200 μl时，容易发生分子内连接。

对于质粒载体 (约3,000 bp)： 浓度大于1 μg/25 μl时，容易发生分子间连接；浓度小于1 μg/50 μl时，容易发生分子内连接 。 Q-3: 平滑末端及突出末端的连接效率的差别？

A-3: 取决于末端碱基序列。

连接反应因末端碱基顺序的不同而反应速度各异，一般有下列倾向：

突出末端：Hind III>Pst I>EcoR I>BamH I>Sal I

平滑末端：Hae III>Alu I>Hinc II>Sma I

EcoR V>Sca I>Pvu II>Nru I

其中连接Hind III末端的速度约为连接Sal I末端速度的10～40倍；而连接Hae III末端的速度约为连接Sma I末端速度的5～10倍。与平滑末端相比，突出末端的连接效率大约高出100倍以上。

Q-4: 在10%聚乙二醇存在的条件下，可以进行转化吗？

A-4: 在100 µl感受态细胞中加入小于10 µl的连接液 (含10% PEG)进行转化没有问题。有可能的话，建议通过乙醇沉淀进行Buffer交换。 Q-5: 要想让DNA环化，盐浓度 (NaCl、KCl等)多少为好？

A-5: 想使DNA环化 (Self ligation)时，请使用不含一价盐的缓冲液。PEG及高盐浓度可以促进分子间的连接反应；而对于分子内的连接反应，使用不含盐的Buffer可以得到更好的效果。 ↑TOP Q-6: 连接液是否需要乙醇沉淀纯化之后再转化？

A-6: 热击转化时，无需乙醇沉淀，可用连接液直接转化。 电转化时，需要对连接液进行乙醇沉淀纯化，去除盐离子再进行转化。

乙醇沉淀的步骤：

1.加入1/10体积的3 M CH3COONa (pH5.2)，混匀。

2.加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。

3.12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀。

4.用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min，除去上清，真空或室温干燥沉淀，注意不要干燥过度。

5.使用25～50 µl TE Buffer溶解，取10～20 µl转化至100 µl的感受态细胞中。 ↑TOP Q-7: T4 DNA Ligase与DNA Ligation Kit Ver.2.0 (TaKaRa Code：D6022)的区别。

A-7: T4 DNA Ligase经过长达16小时的连接反应才能连接成功，而且反应常常受到DNA末端结构的影响。

DNA Ligation Kit Ver.2.0中的Solution I含有T4 DNA Ligase，利用了T4 DNA Ligase及其相应的最佳缓冲体系，由于它的高效连接性能，可以将反应时间缩短至半个小时，并且不受DNA结构的影响。在使用DNA Ligation Kit进行环状DNA连接时，只需向DNA溶液中加入一种溶液Solution I，即可在短时间内完成DNA连接。 ↑TOP T4 RNA Ligase

Q-9: T4 RNA Ligase的应用。

A-9: 该连接酶主要是应用于单链分子内连接的环化反应以及分子间的连接反应。最小底物为NpNpNOH (3’ -OH Oligomer、受体)、pNp (5’ 、3’ -DP monomer、供体)。连接效率受供体和受体各自的碱基影响很大。与RNA相比DNA连接的效率较低。 应用试剂盒：5’ -Full RACE Kit (TaKaRa Code：D315) ↑TOP Q-10: 使用T4 RNA Ligase要注意哪些问题？

A-10:

a.分子间连接反应的最适反应温度为5～15℃，若超过该温度活性会被抑制。

b.在PEG共存的条件下能够促进反应，而反应特异性不变。为了提高连接反应效率，建议使用酶浓度高而ATP浓度尽量低的反应条件。

c.在10×反应缓冲液中如果直接加入0.1%的BSA会产生大量白色沉淀，因此在配制反应液时，请按下面顺序添加试剂：

dH2O→10×Buffer→0.1% BSA→底物RNA or DNA 。 Q-11: 使用T4 RNA Ligase如何终止反应？

A-11: 加入2 µl的0.5 M EDTA螯合Mg2+终止反应。 二、Alkaline Phosphatases

Q-1: 虾来源的酶 (SAP)、大肠杆菌来源的酶 (BAP)、小牛肠来源的酶 (CIAP)特性比较。

A-1:

A-2:

为有效降低线性化质粒的自连背景，需在连接反应前将线性化载体去磷酸化，因此要用到碱性磷酸酶。

BAP、CIAP和SAP三种碱性磷酸酶都可以去除载体或片段的5’ -末端磷酸基团，但失活方法不同。

CIAP：在保存条件下极其稳定，但在螯合剂存在的条件下，经65℃、30分钟加热处理，99%的活性不可逆失活 (根据反应条件不同有时也有例外)。建议失活处理时使用苯酚，可使酶完全失活。

BAP：是一种稳定性很高、每一个酶分子中含有2个Zn2+的金属蛋白质。在螯合剂存在的条件下，100℃加热可暂时性失活，但由于恢复至室温时酶活性可以恢复，因此必须进行苯酚处理，才能使其完全失活。

SAP：只要乙醇沉淀即可失活。

注：

苯酚/氯仿抽提方法：

1. 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇 (25：24：1)，振荡2～3 min充分混匀。

2. 室温12,000 rpm离心，取上层 (水层)移至另一微量离心管中。

3. 加入等体积的氯仿/异戊醇 (24：1)，振荡2～3 min充分混匀。

4. 室温12,000 rpm离心，取上层 (水层)移至另一微量离心管中。 然后进行乙醇沉淀纯化。

乙醇沉淀的步骤：

1. 加入1/10体积的3 M CHMgCl3COONa (pH5.2)，混匀。

2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。

3. 12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀。

4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min，除去上清，真空或室温干燥沉淀，注意不要干燥过度。

Q-3: SAP降解PCR反应后残存dNTP的反应体系。

A-3:

PCR Product 6 µl

SAP (1 U/µl) 0.2 µl

Exonuclease I (5 U/µl) 0.2 µl

dH2O Up to 10 µl

Q-4: 提高Alkaline Phosphatases去磷酸化效率的方法。

A-4:

1. 提高反应温度进行反应 (BAP：65℃，CIAP：约50℃)。

2. 把反应液中的Tris的浓度提高到1 M。

Q-5: 限制酶处理后，不经过Buffer更换可以直接使用CIAP吗？

Q-6: CIAP对金属离子的要求如何？

Q-7: 5’ 末端结构不同，反应条件有何不同？

Q-8: 载体去磷酸化反应后，如何检测？

A-8:

推荐使用苯酚/氯仿/异戊醇抽提或凝胶回收纯化去磷酸的线性化DNA

检测去磷酸化反应效果的方法：

1. 将去磷酸化处理的酶切线性载体，进行连接、转化、涂板。

2. 将酶切线性载体进行转化、涂板。

3. 将酶切线性载体进行连接、转化、涂板。

载体用量：大约0.03 pmol以上即可。

三、DNA Polymerase

DNA Polymerase

Q-1: 各种DNA Polymerase的特性比较。

Q-2: Klenow Fragment的补平反应体系及反应条件。

A-2:

DNA 500 ng

10×buffer 2.5 µl

dNTP final 0.1 mM

Klenow 0.5 U

dH2O Up to 25 µl

Q-3: Klenow和T4 DNA Polymerase有何差别？

A-3: T4 DNA Polymerase具有比Klenow Fragment高出100～1,000倍的3’ -Exonuclease活性。但Klenow不象T4 DNA Polymerase那样易受DNA二级结构的影响。因此，Klenow一般用于Dideoxy法测序、DNA的3’ 凹陷末端补平以及3’ -末端标记；而T4 DNA Polymerase则用于DNA置换合成以及3’ -末端平滑化。

另外，对于dNTP〔αS〕的活性也不同。Klenow虽然能使dNTP〔αS〕掺入，但不能利用Exonuclease活性切除。所以想使DNA只从单方向缺失时，使用Klenow和dNTP〔αS〕修复一端后，其末端会对Klenow的Exonuclease活性以及BAL 31、Exo III等活性产生拮抗作用。而T4 DNA Polymerase即使掺入了dNTP〔αS〕也会切除掉。 ↑TOP

Q-4: Klenow用于DNA末端的修复后，连接效率并不好，为什么？

Q-5: 想在16～22℃使用Klenow，此时的相对活性是什么？

Q-6: Klenow用于DNA修复时，DNA好像少量被分解了，为什么？

Q-7: 为什么用Klenow和ddNTP进行末端标记的效率不理想？

Q-8: 想用T4 DNA Polymerase将3’ 突出末端切成平末端时，dNTP必须吗？

反转录酶相关问题

Q-11: 合成不了长链cDNA的原因是什么？

A-11: 加入2 µl的0.5 M EDTA螯合Mg2+终止反应。

1. RNase的原因 (cDNA的电泳谱带出现模糊)。 对使用的器具、试剂请尽可能干热或者湿热灭菌处理。同时，在反应时请加入Ribonuclease Inhibitor。

2. 反应条件不适合 (cDNA的合成量少)。 请通过预备实验探讨适合的反应条件，此时所要研讨的项目包括：酶量、盐浓度、反应温度 (37～65℃)、DTT浓度 (0.5～10 mM)。

TdT相关问题

Q-12: 使用TdT酶要注意哪些问题？

酶催化dNTP聚合于单链或双链DNA的3’ -OH末端的反应，该反应不需要模板，但引物必须是至少有3个以上碱基的寡核苷酸。

TdT通过Okayama-Berg法被广泛运用于给载体、cDNA加上互补同聚尾的反应。反应受以下条件的影响：

1. 附加碱基的种类 (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)

2. 反应缓冲液中二价阳离子的种类 (Mg2+，Co2+，Mn2+)

3. DNA末端结构 (3’-OH突出末端，平滑末端，3’-OH凹陷末端)。 反应时要根据情况选择最佳反应条件。一般，附加dATP和dTTP时，选择Co2+的Buffer；而附加的dCTP和dGTP时，选择含有Mn2+的Buffer为最适。附加15～40 bases核苷酸的最佳反应条件为：

突出3’-OH末端：dNTP与DNA的摩尔比为20：1。

凹陷3’-OH末端：dNTP与DNA的摩尔比为100：1。

四、RNA Polymerase

Q-1: 使用RNA Polymerase应注意哪些问题？

A-1:

反应体系中须严格注意不要混入RNase。 实验器材 (如：枪头、Microtube等)注意严格使用RNase Free用品。 实验操作时请注意戴一次性手套，防止RNase污染。

SP6 RNA Polymerase方面：

1. 最适pH为7.5，需要Mg2+和还原剂的存在，添加BSA及亚精胺可提高酶的活性。

2. 最适反应温度为40℃ (此时酶活性为37℃时的130%)，当所用酶量不超过300 U/ml，模板量不超过0.1 mg/ml时与RNA的合成量呈正比例。如果反应时间超过1小时，反应温度以37℃为好。

T7 RNA Polymerase 方面：

1. 最适pH为7.7～8.3。需要Mg2+和还原剂的存在，添加BSA及亚精胺可提高酶的活性。

2. 为了特定领域的有效转录，建议在其领域下游把模板DNA预先切成平端或5’ 突出末端。

3. 为了T7 RNA Polymerase能够进行有效反应，在设计合成用于体外转录的模板用Oligo DNA时，T7 Promoter序列之前 (5’ 端方向)应多加6个碱基。根据我们的经验，以加GATCAC为佳。

五、Nuclease

Q-1: 各种Nuclease的特性比较。

Q-2: 各种核酸酶的使用注意事项。

A-2:

1. Mung Bean Nuclease

与S1 Nuclease不同，不能切断切口对侧的链。

2. BAL 31 Nuclease

a. 单链Endonuclease活性在反应温度从30℃降到20℃时，大约下降到1/10左右，而双链Exonuclease活性大约残留1/3左右。

b. Endonuclease活性不受盐浓度影响，但Exonuclease则是盐浓度越高活性越低。

c. Trimming活性的最适盐浓度为NaCl 200 mM左右，若低于此浓度有时表现Nicking活性。

d. 分解活性对碱基的依存性较高，由于GC rich领域 (特别是Sma I site)不易被分解，在酶切时，有必要选择末端限制酶位点。

e. 反应中因各种酶活性的反应分配 (Distributive)关系，对酶浓度有较大的依存，所以对稀释不表现线性关系。当酶反应速度过快时，与其降低酶量，不如降低反应温度。

f. 本酶需要Ca2+的存在，通过使用螯合剂可使其不可逆失活。在NaCl浓度为1 M左右时，该酶对于单链DNA表现出最大活性。相反对于双链DNA，其活性则随着盐浓度的增加而降低。当盐浓度在100 mM以下时，有时会发生随机分解。因此，建议在盐浓度200～600 mM的范围内进行反应。

g. 通过本酶产生的末端的平滑率只有10%左右，为了提高连接效率，建议通过T4 DNA Polymerase进行修复。

3. Exonuclease III

a. 反应在37℃时受各种活性的分配影响 (Distributive)，但在23℃时，如果酶量充分，基本上能以一定的速度分解。

b. 该酶在性质上有这样一个特点：DNA即使具有3’ 突出末端，有时也因其末端及序列的不同而被作为底物降解。

例如：

一个碱基突出型 (Eam1105 I等)

二个碱基突出型 (Pvu I、Sac II等)

三个碱基突出型 (Sfi I等)

四个碱基突出型 (Apa I，Ban II及BstX I有可能)

4. Micrococcal Nuclease

本酶的活性严格依赖于Ca2+的存在，用EDTA或EGTA可以终止反应。

5. Deoxyribonuclease I

a. 本酶最适pH值为中性附近，稳定pH值为5～6。

Q-3: 末端平滑时S1 Nuclease与Mung Bean Nuclease的区别？

Q-4: Mung Bean Nuclease作用后DNA电泳条带模糊，是切入 (Nibbing)了吗？

Q-5: 在BAL 31 Nuclease的反应液中，加入了600 mM的高浓度NaCl，对反应有没有影响？

Q-6: BAL 31 Nuclease对Nick (切口)作用吗？

Q-7: 只想从末端除去几个核苷酸时，用通常的反应条件切过了怎么办？

Q-8: Exo III作用于DNA后进行Agarose电泳时，出现电泳带模糊，是非特异性的Nuclease污染吗？

Q-9: DNase I (RNase Free)的使用注意事项。

DNase I (RNase Free)的RNase Free是相对的，如果不是必要的话，可以不去除RNA中的gDNA，而是通过设计引物来避免扩增gDNA模板，同时做负对照 (不加反转录酶)来检验实验结果。

六、DNA Topoisomerase I，T4 Polynucleotide Kinase，Ribonuclease Inhibitor

Q-1: 使用DNA Topoisomerase I要注意哪些问题？

1. pBR322 DNA和φX174 DNA的RF I (超螺旋分子)用DNA Topoisomerase I反应后电泳，胶中含溴乙锭 (EtBr)时，反应前后DNA带的位置不发生变化。这是因为由DNA Topoisomerase I作用而转换为松散型的DNA受EtBr的影响，再次变为超螺旋状态。因此，使用Topoisomerase I反应后，一般使用不含EtBr的琼脂糖凝胶电泳，电泳终了后再用EtBr染色。

Q-2: T4 Polynucleotide Kinase催化5’ 末端标记反应的效率如何？

T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK)催化的核酸5’ 末端标记反应的效率受5’ 末端形状的影响较强。一般效率按：单链末端≥双链5’ 突出末端＞双链平滑末端＞双链3’ 突出末端的顺序降低。特别是由于双链的缺口 (Gap)及切口 (Nick)部分的磷酸化非常困难，所以，为了提高标记效率需要使用高浓度、过量的ATP。另外，即使同为平滑末端，富含AT的末端标记效率较高。

Q-3: T4 Polynucleotide Kinase的失活方法。

Q-4: 使用T4 PNK标记DNA时，能用〔γ-35S〕代替〔γ-35P〕ATP吗？

Q-5: 使用Ribonuclease Inhibitor要注意哪些问题？

A-5:

1.抑制活性的pH值范围较广，在pH 7～8时表现最大活性。

2.起泡或强烈搅拌 (Vortex等)会引起失活。

3.不抑制RNase H活性。 ↑TOP