1 ．总RNA 的提取（Northern 杂交）

2 ．第一链合成：

(1) 总RNA 样品 2 μg ；cDNA 合成引物 1 μl ；加ddH2 O 补至5 μl 。将管标号为1A ,2A ,PC A 等。PC 为阳性对照。

(2) 混匀后稍离心。

(3 ）70 ℃ 孵育3min ，冰浴2min 后稍离心。

(4 ）准备dNTP mix ( 以5 管为例 )

每管 5 管

5 ×第一链缓冲液 2 μl 10 μl

dNTPmix （各5mM ） 2 μl 10 μl

MMLV 逆转录酶（200u/ μl ） 1 μl 5 μl

5 μl 25 μl

(5 ）每管加入5 μl ，混匀后稍离心。

(6 ）42 ℃ 孵育1hr 。

(7 ）75 ℃ 10min 终止反应后置冰上，稍离心。

(8) 将2 μl 反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B 等）。

(9) 将78 μl ddH2 O 分别加入B 管中, 混匀。

(10) 将72 μl ddH2 O 分别加入A 管中，混匀。

(11 ）将所有cDNA 稀释液 -20 ℃ 保存待用。

3 ．dd-PCR: 以 引物P1,T9 为例说明

（0.5ml PCR 管,1 代表对照组,2 代表实验组）

管号 cDNA 样品 引物

(1) 1A P1,T9

(2) 1B P1,T9

(3) 2A P1,T9

(4) 2B P1,T9

(5) H2 O P1,T9

(6) RNA1 P1,T9

(7) RNA2 P1,T9

以下为阳性对照反应体系

(8) PC 1A P10,T8

(9) PC 1B P10,T8

(10) PC 2A P10,T8

(11) PC 2B P10,T8

(12) H2 O P10,T8

(13) PC RNA1 P10,T8

(14) PC RNA2 P10,T8

在PCR 管中加入:

① cDNA 样品 1 μl

P 引物 1 μl

T 引物 1 μl

② 准备其它 PCR 试剂的混合液: ( 在另一管中加入)

成分 每管( μl) 所需管数( n=14)

10 ×buffer 2.0 2n

ddH2 O 14.0 14n

dNTPmix 0.2 0.2n

α-32 P dATP 0.4 0.4n

Taq 酶 0.4 0.4n

终体积 17.0 17 n

混匀后稍离心。

③ 将17 μlPCR 混合液加入各反应管，则各管总体积为20 μl 。

④ 开始PCR 扩增。

⑤ PCR 循环参数：

在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序：

94℃ 5min

1 cycles 40℃ 5min

68℃ 5min

94℃ 30sec

2 cycles 40℃ 30sec

68℃ 5min

94℃ 20sec

23 cycles 40℃ 30sec

68℃ 2min

1 cycles 68℃ 7 min 。

⑥ 反应结束后置-20 ℃ 保存备用。

4 ．电泳和放射自显影

(1 ）配制6% 变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。

(2 ）预电泳30min 。

(3 ）每个dd-PCR 反应取出5 μl 于一新微量离心管中，加5 μl loading

buffer ，混匀，离心，置94 ℃ 变性2min 。立即置冰浴。

(4) 停止预电泳，冲洗加样孔。

(5) 加样2 μl 。70W 电泳2.75hr 至二甲苯青到达胶的底部。

(6 ）下胶：（同测序胶）

(7 ）干胶：在胶表面覆上保鲜膜，80 ℃ 干胶30min 。

(8)X 光片-70 ℃ 曝光过夜或更长时间( 根据射线强度而定) 。

图2-6 显示了dd-PCR 放射自显影的X 光片

5 ．差异条带回收再扩增

(1 ）X 光片经D72 显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X 光片灯上比较寻找差异条带。

(1) 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2 O 20 μl ，沸水浴15min ，离心取上清为模板。

(3) 以原引物扩增：

回收DNA 7 μl

10 ×PCR buffer 5 μl

5mM dNTPmix 0.5 μl

引物P 2.5 μl

引物T 2.5 μl

Taq 酶 2 μl

加ddH2 O 至总体积为50 μl

(4) 执行PCR 程序:

93℃ 3min ；93 ℃ 1min →60 ℃ 1min →68 ℃ 2min ，20 次循环；68 ℃ 5min 。

(5) 取PCR 产物10 μl 2% 琼脂糖电泳检测。

(6) PCR 产物乙醇沉淀，10 μlddH2 O 溶解。

6 ．以PCR 产物为探针，标记后进行Northern 杂交，证实基因的真实性。

7 ．PCR 产物的TA 克隆。

8 ．DNA 序列测定。

9 ．检索分析。