定磷法测定核酸的含量
【 实验目的 】 掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法 【 实验原理 】 核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%,DNA含磷量约为9.2%),测定其含磷量即可求出核酸的量。 核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷,在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀,其反应为: 在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内,蓝色的深浅与磷含量成正比,可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷,需作对照测定,消除无机磷的影响,以提高准确性。 【 实验材料 】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计
2.实验 试剂
(1)标准磷溶液:将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重,准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中,转移至500ml容量瓶中,加入5ml 5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴,用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1含磷400µg,临用时准确稀释20倍(20µg/m1)。
(2)定磷 试剂
① 17%硫酸:17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。
②2.5%钼酸铵溶液:2.5g钼酸铵溶于100ml水。
③10%抗坏血酸溶液:10g抗坏血酸溶于100ml水,并贮存于棕色瓶中,溶液呈淡黄色尚可使用,呈深黄甚至棕色即失效。
临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合:溶液(1):溶液(2): 溶液(3):水=1:1:1:2(V: V)
(3)5%氨水, 27%硫酸 【 实验操作 】
1.磷标准曲线的绘制
取干燥 试管 7支编号,按表所示加入试剂。
试剂 | 管号 | ||||||
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
磷标准溶液,ml | 0.0 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
蒸馏水,ml | 3.0 | 2.95 | 0.9 | 2.8 | 0.7 | 2.6 | 2.5 |
定磷试剂,ml | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
A 660 |
加毕摇匀,在45℃水浴中保温10min,冷却,以零号管调零点,于660nm处测吸光度。以磷含量为横坐标,吸光度为纵坐标作图。
2.总磷的测定
称粗核酸0.1g,用少量水溶解(若不溶,可滴加5%氨水至pH7.0),待全部溶解后,移至50ml容量瓶中,加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1),即配成核酸溶液。
吸取上述核酸溶液1.0ml,置大 试管 中,加入2.5m1 27%硫酸及一粒玻璃珠,于通风橱内直火加热至溶液透明(切勿烧干),表示消化完成。
冷却后取下,将消化液移入100ml容量瓶中,以少量蒸馏水洗涤试管两次,洗涤液一并倒入容量瓶,再加蒸溜水至刻度,混匀后吸取3m1溶液置试管中,加3m1定磷试剂,45℃ 水浴 保温10min后取出, 测A 660 。
3.无机磷的测定
吸取核酸溶液1ml,置于100ml容量瓶中,加水至刻度,混匀后吸取3.0ml置试管中,加定磷试剂3.0m1,45℃ 水浴 中保温10min后取出, 测A 660 。
4.结果处理
总磷A 660 -无机磷A 660 =有机磷A 660
从标准曲线上查出有机磷微克数(X),按下式计算样品中核酸百分含量
【 实验结果讨论 】
定磷法即可以测定DNA的含量又可以测定RNA的含量,若DNA中混有RNA或RNA中混有DNA,都会影响结果的准确性。
【 思考 】
定磷法操作中有哪些关键环节?